劉 莎 韓 梅 鄭 斌 苗穗兵 付建然 尉 坤 張 靜 溫進(jìn)坤

(河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室 神經(jīng)與血管生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017)

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)(PTCA)是臨床治療冠狀動(dòng)脈疾病的重要手段，但術(shù)后再狹窄的高發(fā)生率嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期療效〔1〕。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖并向內(nèi)膜下遷移是血管再狹窄的主要病理基礎(chǔ)。苯磺酸氨氯地平(AM)是具有高度血管選擇性的鈣離子拮抗劑，是臨床治療高血壓的一線藥物。研究表明，AM除具有良好的降壓作用外，還具有許多L-型鈣通道阻滯劑作用以外的生物學(xué)活性〔2〕。阿托伐他汀(AT)是臨床上常用的降脂藥，AT除具有強(qiáng)效降脂作用外，還具有不依賴于降脂的多效性作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，AM與AT聯(lián)合用藥可保護(hù)血管內(nèi)皮。雖然聯(lián)合應(yīng)用AM及AT對(duì)于血管的協(xié)同保護(hù)效應(yīng)已被逐步認(rèn)可，但二者單獨(dú)及聯(lián)合用藥是否影響球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成尚無(wú)定論。本研究從整體、細(xì)胞和分子水平上探討AM、AT單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;主要實(shí)驗(yàn)儀器購(gòu)自Leica公司及Pharmacia公司;AM(商品名:絡(luò)活喜，批號(hào)95805043)及阿托伐他汀(商品名:立普妥，批號(hào)95837009)購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司;球囊導(dǎo)管本室自制。

1.2 方法

1.2.1 球囊損傷動(dòng)物模型的復(fù)制及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用25%烏拉坦(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，沿頸部正中線切開(kāi)皮膚及皮下組織，于氣管左側(cè)分離肌肉層、頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。從頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端備線，于近心端結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈。將頸總動(dòng)脈近心端用血管夾關(guān)閉血流，于頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端扎線部位的內(nèi)側(cè)剪一楔形切口，球囊導(dǎo)管自切口處向近心端插入，打開(kāi)血管夾，導(dǎo)管穿過(guò)頸總動(dòng)脈至主動(dòng)脈分支處。注入約20 μl生理鹽水充盈球囊，然后將球囊拖回到切口處，其間以導(dǎo)絲為軸線旋轉(zhuǎn)球囊。如此反復(fù)3次，退出球囊，關(guān)閉切口，恢復(fù)血流。

體重250～300 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組(Sham，n=6)、損傷組(Injured，n=6)、AT 組(AT，n=6)、AM組(AM，n=6)、以及AT與AM聯(lián)合用藥組(AT+AM，n=6)。Sham組及Injured組:每日給予同治療組等體積的蒸餾水灌胃。AT組:AT研碎，蒸餾水溶解后，10 mg·kg－1·d－1灌胃。AM 組:AM 研碎，蒸餾水溶解后，10 mg·kg－1·d－1灌胃。AT+AM 組:AM 及 AT 研碎溶解，各 10 mg·kg－1·d－1灌胃。用藥組大鼠于術(shù)前1 d至術(shù)后14 d進(jìn)行灌藥，實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料飲食，自由進(jìn)食進(jìn)水，每日測(cè)量大鼠體重，并隨時(shí)觀察大鼠日常飲食、精神狀態(tài)等一般情況。于術(shù)后14 d從股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，迅速分離左側(cè)頸總動(dòng)脈標(biāo)本用于下述實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)分析 取左側(cè)頸總動(dòng)脈血管0.5 cm置于冷PBS中洗凈殘留血液，放入10%中性甲醛中固定至少24 h，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE染色后，鏡下觀察、照相，進(jìn)行圖像學(xué)分析并計(jì)算內(nèi)膜/中膜(intima/media，I/M)厚度比。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色分析 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟垂直定向包埋，4 μm厚度連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)染色采用SP三步法，即:石蠟切片脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，PBS沖洗，山羊血清封閉液室溫孵育15 min，傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，包括:兔抗PCNA多克隆抗體(1∶100)、兔抗KLF5多克隆抗體(1∶50)、兔抗 MMP-9多克隆抗體(1∶100)，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗，生物素化二抗工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗，滴加DAB試劑顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS替代一抗，其余步驟同上。顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)PCNA、KLF5、MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定:以細(xì)胞中出現(xiàn)棕褐色濃染顆粒作為判定陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 選取80～100 g雄性SD大鼠，取胸腹主動(dòng)脈，用貼塊法分離、培養(yǎng)VSMC〔3〕。細(xì)胞在含10%FBS的低糖DMEM中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% ～90%融合，分別加入AM至終濃度5、10 ng/ml，繼續(xù)孵育24 h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)基用于下述實(shí)驗(yàn)。以含10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白提取與Western印跡分析 收集各組細(xì)胞，冰浴裂解細(xì)胞，4℃ 8 000 r/min離心10 min，收集上清，即為細(xì)胞蛋白提取液，用改良Lowry法測(cè)定各組蛋白濃度后，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取等量各組蛋白提取液，與5×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃沸水浴加熱5 min使蛋白變性。自然冷卻后，用微量加樣器上樣于凝膠加樣孔內(nèi)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(90 V穩(wěn)壓電泳約30 min)，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，換用120 V穩(wěn)壓電泳，至溴酚藍(lán)前緣移動(dòng)到凝膠底部，停止電泳。SDSPAGE完畢后，半干式電轉(zhuǎn)膜(恒壓20 V)。轉(zhuǎn)膜完畢后將PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的TTBS封閉液中，37℃封閉2 h。一抗結(jié)合:將封閉后的PVDF膜置入TTBS適當(dāng)稀釋的一抗溶液中，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。二抗結(jié)合:將PVDF膜置入適量以TTBS 1∶104稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，室溫反應(yīng)2 h。洗膜后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)PVDF膜上抗原抗體結(jié)合區(qū)帶。信號(hào)強(qiáng)度用凝膠成像數(shù)碼分析軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析，密度掃描灰度值用IOD表示。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析 利用常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行分析〔4〕，細(xì)胞分組及處理?xiàng)l件同上。

1.2.7 傷口愈合實(shí)驗(yàn) 將VSMC接種于玻片上，細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后，取出玻片，進(jìn)行劃痕。PBS洗凈被刮下的細(xì)胞后，將玻片置于含AM梯度濃度(5，10 ng/ml)的培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育24 h后取出，固定后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下照相。任意取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，以此表示細(xì)胞的遷移活性。1.2.8 明膠酶圖分析 取各組VSMC的培養(yǎng)液與上樣緩沖液混勻，上樣于凝膠加樣孔內(nèi)。4℃條件下恒壓(120 V)電泳2～2.5 h，至溴酚藍(lán)前沿移動(dòng)至凝膠底部約1 cm處時(shí)，停止電泳。凝膠經(jīng)2.5%Triton X-100漂洗以去除凝膠中的SDS，使明膠酶復(fù)性;棄去漂洗液，加入反應(yīng)緩沖液37℃ 溫育9 h，使明膠酶充分水解凝膠中的明膠。棄去反應(yīng)緩沖液，加入考馬斯亮藍(lán)染色液染色2～4 h;棄去染色液，加入脫色液脫色2～4 h，至藍(lán)色背景下白色條帶清晰為止。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取其均值，各組數(shù)據(jù)以±s表示。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 AM和AT抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成 術(shù)后14 d，取大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈制備組織切片，經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察可見(jiàn)，Sham組頸總動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑僅見(jiàn)單層內(nèi)皮細(xì)胞，中膜VSMC排列整齊呈梭形，I/M厚度比值為0.17±0.10(圖1)。Injured組血管中膜內(nèi)VSMC排列紊亂，內(nèi)膜呈彌散性增厚，管腔縮小，I/M厚度比值顯著增大(3.40±0.17)，與Sham組相比具有顯著性差異(P＜0.01)。AM組、AT+AM組的I/M厚度比值分別為1.86±0.26和0.58±0.23，與Injured組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，聯(lián)合用藥組的抑制效果更顯著(P＜0.01)，而AT組的內(nèi)膜增生程度與Injured組相比無(wú)明顯差異，其I/M厚度比值為(3.16±0.22)。

圖1 各組I/M形態(tài)學(xué)觀察(HE，×100)

2.2 AM和AT抑制球囊損傷誘導(dǎo)的PCNA、KLF5和MMP-9的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，正常血管壁中偶見(jiàn)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞，Injured組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及單細(xì)胞染色強(qiáng)度較Sham組均顯著增高，且主要分布在新生內(nèi)膜層。與Injured組相比，AM組和AT+AM組中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別減少了59.1%及73.4%(圖2)，具有顯著性差異(P＜0.01)，且聯(lián)合用藥組的抑制效果大于AM單獨(dú)用藥組(P＜0.01)。AM和AT對(duì)血管壁中KLF5及MMP-9表達(dá)的影響與PCNA相似，與Injured組相比，AM組和AT+AM組中，KLF5陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)分別減少了57.9%及74.2%(圖 2)，MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別減少了39.4% 和81.8%(圖2)。提示，AM單獨(dú)及與AT聯(lián)合用藥抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成與抑制增殖相關(guān)蛋白PCNA、KLF5和遷移相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)有關(guān)。

圖2 各組 PCNA、KLF-5、MMP-9表達(dá)

2.3 AM抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖活性 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，AM(5，10 ng/ml)處理VSMC 24 h后，血清誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活性降低，與對(duì)照組(0 ng/ml)相比，細(xì)胞數(shù)分別減少了30.8%及45.8%，具有顯著性差異(P＜0.05)，且其增殖抑制作用具有濃度依賴關(guān)系。Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 ng/ml)相比，AM處理的VSMC中，PCNA水平分別降低了11.1%及28.3%，KLF5水平分別減少了16.3%及28.3%，c-Jun水平分別減少了22.5%及32.8%(圖3)。AM對(duì)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)具有濃度依賴性，與細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果一致。

圖3 各組PCNA、KLF-5、c-Jun的水平

2.4 AM抑制體外培養(yǎng)的VSMC遷移活性 見(jiàn)圖5。傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度AM(5，10 ng/ml)處理VSMC 24 h后，血清誘導(dǎo)的VSMC遷移活性較對(duì)照組(0 ng/ml)分別降低了28.8% 和69.8%(圖4)，具有顯著性差異(P＜0.05)。明膠酶圖分析結(jié)果顯示，AM可濃度依賴性的降低MMP-2及MMP-9的膠原酶活性。AM對(duì)MMP活性的影響與細(xì)胞遷移活性變化相一致。

圖4 AM抑制VSMC的遷移活性

圖5 AM對(duì)MMP活性的影響

3 討論

PTCA是目前臨床治療冠狀動(dòng)脈疾病的重要手段，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PTCA術(shù)后3～6個(gè)月內(nèi)，原擴(kuò)張部位的再狹窄率高達(dá)32% ～57%，嚴(yán)重限制了其遠(yuǎn)期臨床療效〔1〕。PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生大致分為3個(gè)主要階段:①血管內(nèi)皮損傷后VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停@得增殖能力，合成并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì);②中膜VSMC大量增殖并向內(nèi)膜下遷移;③損傷部位增殖的VSMC和沉積的細(xì)胞外基質(zhì)共同形成血管新生內(nèi)膜，并向管腔突起，最終導(dǎo)致管腔狹窄〔5〕。

AM是目前循證證據(jù)最多、應(yīng)用最廣的降壓藥之一，AM除具有良好的降壓作用外，還具有許多L-型鈣通道阻滯以外的血管生物學(xué)活性〔2〕，如促進(jìn) NO 生成、改善內(nèi)皮功能〔6〕、抗動(dòng)脈粥樣硬化〔7〕等。AT除具有強(qiáng)效降脂作用外，還具有不依賴于降脂的多效性作用，如誘導(dǎo)人和大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡〔8〕及保護(hù)血管內(nèi)皮〔9〕等。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，AM及AT對(duì)血管具有協(xié)同保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)大鼠頸動(dòng)脈球囊剝脫模型，觀察到二者具有協(xié)同抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成的作用。

為探討AM及AT抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了增殖相關(guān)蛋白PCNA、KLF5及遷移相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)變化。PCNA在DNA復(fù)制及核苷酸切除修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)，PCNA表達(dá)水平的高低可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的可靠指標(biāo)〔10〕。KLF5是KLF家族中的一個(gè)成員，是一個(gè)重要的生長(zhǎng)促進(jìn)基因和分化抑制基因〔11〕，且在血管損傷后的重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是體內(nèi)較為重要的一類蛋白水解酶，在基質(zhì)重構(gòu)及VSMC遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔12〕。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，AM單獨(dú)及與AT聯(lián)合用藥均使PCNA、KLF5及MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。提示，二者抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成與抑制VSMC增殖及遷移活性有關(guān)。

為進(jìn)一步探討AM抑制新生內(nèi)膜形成的機(jī)制，筆者又在細(xì)胞及分子水平進(jìn)行了研究。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，AM濃度依賴性抑制血清誘導(dǎo)的VSMC增殖活性;Western印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AM處理的VSMC中，增殖相關(guān)蛋白PCNA、KLF5及c-Jun表達(dá)水平濃度依賴性降低。提示AM具有抑制細(xì)胞增殖的作用，與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果相一致。傷口愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AM以濃度依賴方式抑制VSMC遷移活性;同時(shí)，明膠酶圖分析顯示，同樣條件處理的VSMC，其MMP-2及MMP-9的活性降低，作用具有濃度依賴性。由此可推斷，AM抑制VSMC的增殖、遷移活性可能是其抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜形成的機(jī)制。

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