李中平 任文輝 張保麗 藺美玲 陳紅梅 趙 麗 王志強 張小郁

(蘭州大學基礎醫(yī)學院生理學與心理學研究所，甘肅 蘭州 730000)

目前，許多人工合成的降血糖藥物都很昂貴且長期服用有許多副作用，而從天然植物中提取出來的抗糖尿病藥物具有低毒性、低副作用等優(yōu)點。檳榔堿是檳榔種子中所含生物堿的主要成分，有研究表明檳榔有抗炎、抗過敏作用，低劑量檳榔堿能夠改善2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂〔1～3〕。但是檳榔堿對INS-1胰島細胞的有關研究尚少。因此，本文體外建立鏈脲佐菌素(STZ)致胰島細胞損傷模型，研究檳榔堿對STZ損傷胰島細胞的保護和修復作用及其機制，為檳榔堿治療糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胰島素瘤細胞(INS-1細胞)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑 檳榔堿(Arecoline)，純度＞98%，為陜西旭煌植物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。RPMI 1640、胰蛋白酶均購自Gibco公司。STZ、十二烷基硫酸鈉(SDS)、噻唑藍(MTT)均購自Sigma公司。新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品?？偪寡趸芰?TAOC)和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，用UV-VIS 756MC分光光度計檢測。胰島素由蘭州市中國人民解放軍第一醫(yī)院檢驗科測定。

1.3 儀器 微孔板分光光度計(Power Wave X BIO-TEX INSTRUMENTS.INC)，GC-1200 γ 放射免疫計數(shù)儀(合肥)，倒置顯微鏡(OLYMPUS CKX41)，EPPENDORF 5810R型臺式冷凍離心機(德國艾本德股份公司)，CO2孵箱(inCu safe copper ALLOY STAINLESS)，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化廠)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 用含10%新生牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，1 mmol/L 丙酮酸鈉，50 μmoL/L β-巰基乙醇，5.6 mmol/L 葡萄糖，1×105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次。

1.4.2 檳榔堿對INS-1細胞胰島素釋放的影響 將密度為1×105/ml的INS-1細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，隨機分為正常對照組、檳榔堿組(1 ×10－5mol/L、1 ×10－6mol/L、1×10－7mol/L)，每組6個復孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將上述各組藥物加入各孔，12 h后收集細胞上清，放射免疫法檢測胰島素的釋放量。

1.4.3 檳榔堿對INS-1細胞增殖活力的影響 如1.4.2方法制備細胞懸液并分組，并設空白調零孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各孔分別加5 mg/ml MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加10%SDS于37℃放置過夜后，用酶標儀測定OD570nm值。

1.4.4 檳榔堿對STZ所致INS-1細胞損傷的保護和修復作用

如1.4.2方法制備細胞懸液，隨機分為正常對照組、STZ 3 mmol/L組、保護組(檳榔堿1×10－5mol/L+STZ、檳榔堿1×10－6mol/L+STZ、檳榔堿 1 × 10－7mol/L+STZ)與修復組(STZ+檳榔堿 1×10-5mol/L、STZ+檳榔堿 1×10－6mol/L、STZ+檳榔堿1×10－7mol/L)，每組6個復孔，并設空白調零孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，保護組將上述藥物加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h;修復組先加3 mmol/L STZ作用6 h再加檳榔堿作用6 h，隨后收集細胞上清，用放射免疫法測其胰島素的釋放量，同時用MTT法測其各孔的OD值。

1.4.5 檳榔堿對INS-1細胞生成MDA和T-AOC能力的影響

如上述方法制備細胞懸液，隨機分為正常對照組、STZ組、保護組(檳榔堿1×10－6mol/L+STZ)與修復組(STZ+檳榔堿1×10－6mol/L)，每組6個復孔。收集細胞上清，按照試劑盒說明書采用TBA法測定MDA的含量，比色法測定T-AOC的含量。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，各項指標均以±s表示。

2 結果

2.1 檳榔堿對INS-1細胞增殖活力和胰島素釋放的影響 與正常對照組比較，檳榔堿顯著促進了INS-1細胞的增殖活力和胰島素釋放量，但其濃度效應關系不明顯。見表1。

表1 檳榔堿對INS-1細胞增殖活力和胰島素釋放的影響(± s，n=6)

表1 檳榔堿對INS-1細胞增殖活力和胰島素釋放的影響(± s，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01

組別 OD值 胰島素釋放量(μIU/L正常對照組)0.347±0.015 1.17±0.09檳榔堿組(1×10－5mol/L) 0.439±0.0181) 2.95±0.351)(1×10－6mol/L) 0.400±0.0121) 3.29±0.411)(1×10－7mol/L) 0.389±0.0181) 3.10±0.531)

2.2 檳榔堿對STZ致INS-1細胞損傷的保護和修復作用 與正常對照組比較，STZ組胰島素釋放量及OD值明顯降低;與STZ組比較，保護組和修復組的OD值和胰島素釋放量顯著升高，說明檳榔堿對STZ所致INS-1細胞損傷有一定的保護和修復作用。見表2。

2.3 檳榔堿對INS-1細胞MDA生成和T-AOC能力的影響

與正常對照組比較，STZ組MDA含量顯著升高，而T-AOC顯著降低;與STZ組比較，檳榔堿保護組和修復組MDA含量均顯著降低，而T-AOC含量均顯著升高，說明STZ致INS-1細胞損傷可能是通過提高MDA的生成量和降低細胞T-AOC來實現(xiàn)的。見表3。

表2 檳榔堿對STZ致INS-1細胞損傷的保護和修復作用( ± s，n=6)

表2 檳榔堿對STZ致INS-1細胞損傷的保護和修復作用( ± s，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與STZ組比較:2)P＜0.01;下表同

組別 OD值 胰島素釋放量(μIU/L)正常對照組0.256±0.021 7.940±0.459 STZ組(3 mmol/L) 0.146±0.0211) 1.198±0.4271)保護組(1×10－5mol/L+STZ) 0.186±0.0141)2) 6.033±0.8631)2)(1×10－6mol/L+STZ) 0.185±0.0131)2) 7.302±0.4962)(1×10－7mol/L+STZ) 0.165±0.0131) 4.388±1.0681)2)修復組(STZ+1×10－5mol/L) 0.258±0.0262) 9.074±1.0871)2)(STZ+1×10－6mol/L) 0.222±0.0512) 5.210±0.4431)2)(STZ+1×10－7mol/L) 0.205±0.0321) 3.717±0.7861)2)

表3 檳榔堿對INS-1細胞MDA生成和T-AOC能力的影響(± s，n=6)

表3 檳榔堿對INS-1細胞MDA生成和T-AOC能力的影響(± s，n=6)

組別 MDA(nmol/ml) T-AOC(kU/L)正常對照組3.16±0.39 2.43±0.27 STZ組 10.23±0.601) 1.30±0.221)保護組 4.05±0.622) 2.01±0.271)2)修復組 3.62±0.562) 2.17±0.242)

3 討論

氧化應激是機體在遭受有害刺激后，產(chǎn)生了過量的活性氧簇(ROS)〔4，5〕，超出了系統(tǒng)對其的消除能力，過剩的 ROS 對細胞的DNA、蛋白質、脂質等造成巨大的損傷，同時也影響細胞信號轉導，導致胰島素基因表達障礙，從而降低胰島素分泌量，導致糖尿病〔6，7〕。STZ可以直接產(chǎn)生ROS，被廣泛的用來制作糖尿病模型。由于胰島β細胞與機體其他細胞相比，細胞內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化水平較低。因此，也更容易受到ROS的損傷。ROS包括活性氧自由基及在細胞內(nèi)外環(huán)境能產(chǎn)生自由基的各種物質，如超氧陰離子、過氧化脂質、過氧化氫以及羥自由基等。ROS可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，并因此形成脂質過氧化物，其代謝產(chǎn)物MDA是一種有害物質，可作為評價脂質過氧化反應強弱的指標〔7〕。從實驗中可以看到，STZ組顯著降低了胰島素的釋放，提高了MDA的生成，并降低了T-AOC能力。與STZ組比較，保護組和修復組胰島素釋放量均顯著升高，MDA含量顯著降低，而T-AOC顯著升高。說明檳榔堿對STZ致INS-1細胞損傷的保護和修復作用可能是通過抑制脂質過氧化產(chǎn)物生成，提高細胞的總抗氧化能力實現(xiàn)的。

另外，與正常對照組比較，高、中、低三個劑量的檳榔堿均顯著促進INS-1細胞的增殖活力和胰島素釋放，但是究竟檳榔堿是通過何種機制來完成這種功能還有待進一步的研究。

綜上所述，本實驗表明檳榔堿明顯促進了INS-1細胞的增殖活力和胰島素釋放，且對STZ損傷的INS-1細胞具有一定的保護和修復作用，為檳榔堿治療糖尿病提供了一定的理論依據(jù)，而檳榔堿對STZ致INS-1細胞損傷的保護和修復作用以及檳榔堿對INS-1細胞增殖活力和胰島素釋放的影響機制仍需進一步的深入研究。

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6 翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學〔M〕.第3版.北京:高等教育出版社，2009:233-40.

7 Kaneto H，Nakatani Y，Kawamori D，et al.Role of oxidative stress，endoplasmic reticulum sress，and c-Jun N-terminal kinase in pancreatic betacell dysfunction and insulin resisitance〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2006;38(5-6):782-93.