葉 青 趙 旭 周 玲 陸 瑩 杜文聰 李 倩 葉新華 俞曉芳 馬建華 成金羅 高燕勤

(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，江蘇 南京 210029)

遺傳因素在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔1〕，其遺傳率估計(jì)為70% ～80%。脂肪組織分泌的脂聯(lián)素被證實(shí)與T2DM關(guān)系密切〔2〕。人體脂聯(lián)素水平除受到脂聯(lián)素基因多態(tài)性本身的影響，還受到有關(guān)調(diào)控基因的影響。在脂聯(lián)素編碼基因ADIPOQ的啟動(dòng)子區(qū)，存在功能性過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)反應(yīng)元件(PPRE)。PPAR-γ與視黃醛X受體α(RXRα)形成的異二聚體直接與PPRE 結(jié)合，激活脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄〔3～6〕。因此，RXRα 是研究T2DM的候選基因之一。此前，本課題組已對(duì)PPAR-γ基因與T2DM遺傳易感性進(jìn)行研究〔7〕，但RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)系未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道。本研究擬探討RXRα基因遺傳變異與江蘇漢族人群T2DM遺傳易感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2008年3月至2010年8月，在江蘇省南京、常州及儀征地區(qū)的南京醫(yī)科大學(xué)三所附屬醫(yī)院，按照1999年WHO推薦的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖≥7.0 mmol/L或口服75 mg葡萄糖后2 h血糖(OGTT)≥11.1 mmol/L以及結(jié)合糖尿病病史，共收集門診或住院的新診斷T2DM的患者1 105例為病例組，其中男性536例，女性569例，平均年齡(57.07±11.11)歲;同時(shí)期同地區(qū)在健康體檢人群中收集正常對(duì)照(無(wú)內(nèi)分泌代謝性疾病史，無(wú)血緣關(guān)系)1 107例，男性516例，女性591例，平均年齡(57.02±11.40)歲，兩組年齡、性別頻數(shù)匹配。病例組和對(duì)照組均來(lái)自漢族人群。

1.2 調(diào)查方法 使用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的調(diào)查表，分別對(duì)患者和健康對(duì)照進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，主要詢問(wèn)內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、T2DM等慢性病病史，測(cè)量身高、體重、血壓、血糖等。上述調(diào)查和采樣均獲得被調(diào)查者同意并簽署知情同意書(shū)。調(diào)查員為本校流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)專業(yè)的研究生和內(nèi)分泌?？漆t(yī)師，經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)合格后，方可參加面訪調(diào)查。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 所有受試者均空腹過(guò)夜，抽取空腹靜脈血和口服75 g葡萄糖2 h后的靜脈血，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血糖、TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白-膽固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白-膽固醇)。病例組所有病人均做GAD(谷氨酸脫羧酶抗體)、ICA512(胰島細(xì)胞抗體)(英國(guó)RSI公司試劑盒)檢測(cè)，以排除1型糖尿病;用PCR/Apal酶切法做線粒體基因突變〔(Trnal EU(UUR)3243A＞G)〕檢測(cè)，以排除線粒體基因突變型糖尿病。低溫(－30℃)保存血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清脂聯(lián)素指標(biāo)。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自RapidBio公司，酶標(biāo)儀型號(hào)BIO-RAD Model680型。

1.3.2 基因位點(diǎn)的檢測(cè)

1.3.2.1 RXRα基因位點(diǎn)的選擇 采用選擇潛在功能性單核苷酸(SNPs)位點(diǎn)的策略:以RXRα基因?yàn)檠芯康哪康幕?，從NCBI、HAPMAP等數(shù)據(jù)庫(kù)以及已發(fā)表的文獻(xiàn)中尋找和確認(rèn)各基因的SNPs位點(diǎn)，選擇在中國(guó)人群具有較高頻率(MAF≥5%)并且可能影響基因功能的SNPs位點(diǎn)為研究靶點(diǎn)。確定了RXRα基因的4個(gè) SNPs位點(diǎn):rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711。探討其與T2DM的易感性關(guān)系。

1.3.2.2 基因型檢測(cè) 抽取研究對(duì)象外周血5 ml，采用酚-氯仿提取、乙醇沉淀的方法提取白細(xì)胞中的基因組DNA，并作為PCR模板。利用Real-time PCR聯(lián)合 Taqman-MGB探針對(duì)RXRα基因的位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。按下列體系加樣(5 μl體系):0.5 μl DNA 模板，2.5 μl TaqMan?Universal PCR Master Mix，0.25 μl順式/反式引物，0.125 μl探針，1.25 μl ddH2O。反應(yīng)條件:2 min 50℃、10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃，40 個(gè)循環(huán)?；驍U(kuò)增的引物和探針序列見(jiàn)表1，利用SDS 2.0軟件(ABI)觀察結(jié)果。每塊384孔板包括2個(gè)來(lái)自同一樣本的陽(yáng)性對(duì)照和2個(gè)空白樣本的陰性對(duì)照。本研究中共檢測(cè)2 212份DNA樣本，成功率為100%，抽取其中10%樣本重復(fù)檢測(cè)，一致性100%。

表1 RXRα基因SNP位點(diǎn)基因擴(kuò)增的引物和探針序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EPIDATA3.1軟件，兩人雙軌錄入全部數(shù)據(jù)資料，核對(duì)無(wú)誤后供分析使用。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析:χ2檢驗(yàn) 、student-t檢驗(yàn)用于分析人口學(xué)的基本特征、T2DM相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)及RXRα基因4個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率在病例組和對(duì)照組的分布差異;Logistic回歸分析計(jì)算OR值及95%CI;擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)用于對(duì)照組基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn);采用LDA〔8〕軟件(Linkage Disequilibrium Analyzer 1.0)分析基因連鎖不平衡;運(yùn)用PHASE 2.0軟件根據(jù)觀察到的基因型推斷單倍型及其頻率。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 在對(duì)照組中，對(duì)RXRα基因的 4 個(gè) SNPs位點(diǎn) (rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711)三種基因型的頻率進(jìn)行遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)分布的差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.458，0.471，0.389，0.703)，說(shuō)明該對(duì)照組人群4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布均符合遺傳平衡法則，具有人群代表性。

2.2 兩組基本資料比較 病例組平均收縮壓、舒張壓、TG、TC、空腹血糖和脂聯(lián)素水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);HDL-C顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。兩組的性別構(gòu)成、平均年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)和LDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 單倍型分析 采用LDA軟件，對(duì)上述4個(gè)位點(diǎn)SNPs的連鎖不平衡分析顯示，4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)處于低連鎖不平衡(D'值0.1～0.8)。RXRα基因4個(gè)潛在功能性位點(diǎn)(順序依次為rs1045570，rs3132291，rs4240711，rs4842194)構(gòu)成的 4 種主要單倍型中，與最常見(jiàn)的單倍型GTAT相比，單倍型TTAT(含變異等位基因rs1045570T)可顯著降低T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)〔調(diào)整OR(95%CI)=0.868(0.801～0.940)〕。見(jiàn)表3。

表2 兩組基本資料比較(±s)

表2 兩組基本資料比較(±s)

變量 病例組(n=1 105) 對(duì)照組(n=1 107) P值男/女(n)536/569 516/591 0.372年齡(歲) 57.07±11.11 57.02±11.40 0.380收縮壓(mmHg) 137.99±20.56 127.93±18.13 ＜0.001舒張壓(mmHg) 85.02±11.80 79.35±10.42 0.002 BMI(kg/m2) 24.88±3.55 24.15±3.27 0.069 HDL-C(mmol/L) 1.14±0.46 1.42±0.37 0.017 LDL-C(mmol/L) 2.82±0.96 2.57±0.89 0.062 TC(mmol/L) 5.16±1.37 5.04±0.95 ＜0.001 TG(mmol/L) 2.62±2.75 1.60±1.04 ＜0.001空腹血糖(mmol/L) 10.91±3.94 5.08±0.53 ＜0.001脂聯(lián)素(mg/L)6.23±1.74 7.14±2.62 ＜0.001

表3 RXRα基因潛在功能性SNPs單倍型與T2DM易感性的關(guān)系

2.4 RXRα基因在病例組和對(duì)照組的基因型分布及其比較RXRα基因4個(gè)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在兩組間的分布無(wú)顯著差異(均P＞0.05)。在調(diào)整性別、年齡和BMI等因素后，仍未發(fā)現(xiàn)4個(gè)位點(diǎn)與T2DM易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表4。

表4 RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性分析〔n(%)〕

3 討論

RXRα是甲狀腺/類固醇受體家族中的一種普通DNA結(jié)合受體。RXRα可被內(nèi)源性激動(dòng)劑9-順式視磺酸激活，同樣能激活 PPAR:RXR 復(fù)合物〔9〕。Metzger〔10〕等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RXRα基因的表達(dá)在脂肪生成及肥大過(guò)程中起重要作用。此外，Wan〔11〕等研究發(fā)現(xiàn)缺乏肝臟RXRα的小鼠攝食量減少，增加體重以及改善糖耐受。Imai〔12〕和 Yang〔13〕都發(fā)現(xiàn) RXRα 在肝細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用。因此，有必要進(jìn)行人群RXRα基因多態(tài)性與T2DM易感性的關(guān)聯(lián)研究。本課題組采用病例對(duì)照研究，探討中國(guó)南方漢族人群RXRα基因標(biāo)簽位點(diǎn)(另已報(bào)道)〔7〕和潛在功能性位點(diǎn)SNPs多態(tài)性與T2DM的關(guān)聯(lián)性。本文4個(gè)潛在功能性位點(diǎn)等位基因頻率與NCBI中中國(guó)人群的數(shù)據(jù)均相接近。經(jīng)多因素回歸分析調(diào)整年齡、性別及BMI后，4個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)與T2DM易感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。

由RXRα基因的4個(gè)潛在功能性位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型分析中，發(fā)現(xiàn)單倍型TTAT(含變異等位基因 rs1045570T)較最常見(jiàn)的單倍型GTAT可顯著降低T2DM的患病風(fēng)險(xiǎn)。推測(cè)變異等位基因rs1045570 T可能需要其他多態(tài)位點(diǎn)協(xié)同而發(fā)揮作用，存在位點(diǎn)-位點(diǎn)間的交互作用。本文樣本人群中攜帶危險(xiǎn)單倍型GTAT者達(dá)到50%以上，從這個(gè)角度而言，這些單倍型攜帶者是T2DM高危人群，更要避免和減少暴露肥胖等環(huán)境危險(xiǎn)因素，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)通過(guò)科學(xué)的生活方式，包括合理膳食及堅(jiān)持體育鍛煉等，控制體重在正常水平，以預(yù)防和延緩T2DM的發(fā)生。值得指出的是本研究的階段性資料(病例520例，對(duì)照550例)中，由于病例和對(duì)照組TTAT單倍型頻率均很低，因此未顯示該單倍型在兩組的頻率分布顯著差異。同時(shí)，其他單倍型或有與本文相反結(jié)果。本文通過(guò)大樣本的病例對(duì)照研究，一方面可以減少樣本含量偏小可能造成的假陽(yáng)性或假陰性錯(cuò)誤，另一方面可以發(fā)現(xiàn)與T2DM易感性相關(guān)的突變頻率相對(duì)較低的RXRα基因單核苷酸遺傳變異位點(diǎn)，從而更客觀地評(píng)價(jià)RXRα基因多態(tài)性在T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用。

鑒于病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)很難避免樣本人群的偏倚問(wèn)題，本文有關(guān)TTAT單倍型可降低T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)現(xiàn)，有必要在其他人群中進(jìn)一步驗(yàn)證，并進(jìn)而通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)得以確定。

1 O'Rahilly S，Barroso I，Wareham NJ.Genetic factors in type 2 diabetes:the end of the beginning〔J〕?Science，2005;307:370-3.

2 Gil-Campos M，Canete R，Gil A.Adiponectin，the missing link in insulin resistance and obesity〔J〕.Clin Nutr，2004;23:963-74.

3 Iwaki M，Matsuda M，Maeda N，et al.Induction of adiponectin，a fat-derived antidiabetic and antiatherogenic factor，by nuclear receptors〔J〕.Diabetes，2003;52:1655-63.

4 Neumeier M，Weigert J，Schaffler A，et al.Regulation of adiponectin re-ceptor 1 in human hepatocytes by agonists of nuclear receptors〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;334(3):924-9.

5 Yamamoto Y，Hirose H，Miyashita K，et al.PPAR(gamma)2 gene Pro12Ala polymorphism may influence serum level of an adipocyte-derived protein，adiponectin，in the Japanese population〔J〕.Metabolism，2002;51:1407-9.

6 Thamer C，Machicao F，F(xiàn)ritsche A，et al.No influence of the PPARgamma2 Pro12Ala genotype on serum adiponectin concentrations in healthy Europeans〔J〕.Metabolism，2003;52:798-9.

7 Juan Du，Hui Shi，Ying Lu，et al.Tagging single nucleotide polymorphisms in peroxisome proliferators activated receptor-γ (PPAR-γ)and retinoid X receptor-α (RXR-α)gene and type 2 diabetes risk:a case-control study of a Chinese Han population〔J〕.J Biom Res，2011;25(1):33-41.

8 Keyue D，Kaxin Z，F(xiàn)uchu HE，et al.LDA-a java-based linkage disequilibrium analyzer〔J〕.Bioinformatics，2003;19:2147-8.

9 Ray DM，Spinelli SL，O'Brien JJ，et al.Platelets as a novel target for PPAR gamma ligands:implications for inflammation，diabetes，and cardiovascular disease〔J〕.BioDrugs，2006;20(4):231-41.

10 Metzger D，Imai T，Jiang M，et al.Functional role of RXRs and PPAR gamma in mature adipocytes〔J〕.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2005;73:51-8.

11 WanYJ，Han G，Cai Y，et al.Hepatocyte retinoid X receptor-alpha-deficient mice have reduced food intake，increased body weight，and improved glucose tolerance〔J〕.Endocrinology，2003;144(2):605-11.

12 Imai T，Jiang M，Kastner P，et al.Selective ablation of retinoid X receptor alpha in hepatocytes impairs their lifespan and regenerative capacity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98:4581-6.

13 Yang X，Guo ML，Yu-Jui Yvonne Wan.Deregulation of growth factor，circadian clock，and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers〔J〕.Am J Pathol，2010;176:733-43.