田 琦 孟 剛 (吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長春 130012)

宮頸癌的形成和演變是一個多因素、多基因共同參與的復(fù)雜而漫長的過程，經(jīng)歷宮頸上皮增生鱗化、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、宮頸浸潤癌等不同階段。p16、ki-67作為癌基因，直接作用于細(xì)胞周期，參與細(xì)胞增殖與分裂，促進(jìn)腫瘤生成。本文應(yīng)用免疫組化S-P法，觀察p16、ki-67在宮頸鱗癌及CIN中的表達(dá)，旨在探討二者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本均來自2009年10月至2010年12月本院病理科存檔資料，其中宮頸鱗癌38例，年齡26～75(平均42)歲，術(shù)前未接受過其他治療，CIN標(biāo)本96例，其中CINⅠ、Ⅱ和Ⅲ分別為28、32和36例，年齡28～65(平均45)歲，收集因子宮肌瘤行子宮手術(shù)的正常宮頸組織14例作為對照。

1.2 主要試劑 兔抗人p16多克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，ki-67為ZM-0166單抗，工作液由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定 全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，每例標(biāo)本行HE染色及S-P免疫組化染色，光鏡觀察。免疫組化步驟按照S-P試劑盒說明書進(jìn)行，一抗?jié)舛葹?∶100，由福州邁新技術(shù)有限公司及北京中杉金橋技術(shù)有限公司提供的陽性對照片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。p16陽性判定標(biāo)準(zhǔn):p16陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性信號，每例隨機(jī)觀察5個高倍視野，用半定量積分判斷結(jié)果:陽性細(xì)胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分，陽性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩項積分相乘，0分為陰性(－)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強(qiáng)陽性()。ki-67陽性判定標(biāo)準(zhǔn):ki-67陽性表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，或細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)同時呈棕黃色，于40倍光鏡下計數(shù)100個細(xì)胞，每例標(biāo)本計數(shù)1 000個細(xì)胞，ki-67指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)總和/1 000×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用χ2檢驗、t檢驗及相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織中p16表達(dá) p16在CIN、宮頸鱗癌組織中有豐富表達(dá)，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在正常宮頸組織中不表達(dá)。p16表達(dá)的陽性程度:宮頸鱗癌接近于CINⅢ高于 CINⅠ、Ⅱ(χ2=6.24，P＜0.05)，CIN 中p16表達(dá)率為63.54%，隨CIN級別的升高而提高，CINⅢ高于CINⅡ(χ2=4.23，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(χ2=4.56，P ＜0.05)，正常宮頸組織與CINⅠ間及CINⅢ與宮頸鱗癌間差異不顯著(P＞0.05)。見表1。

表1 CIN、宮頸鱗癌及正常宮頸組織中p16表達(dá)

2.2 CIN、宮頸鱗癌及正常宮頸組織中ki-67指數(shù) ki-67陽性表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，在宮頸鱗癌及CIN中有較豐富的表達(dá)，在正常宮頸組織中為弱陽性表達(dá)。ki-67指數(shù):宮頸鱗癌(67.82±15.31)高于 CINⅠ、Ⅱ(t=6.18，P＜0.05)，CIN(40.36±11.12)高于正常宮頸組織(2.83±4.56)(t=5.36，P＜0.05)，CINⅢ(60.81±14.32)高于 CINⅡ(29.65±12.58)(t=6.58，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(21.42±10.82)(t=2.15，P＜0.05)，宮頸鱗癌、各期別CIN的ki-67指數(shù)較正常宮頸明顯增加(P＜0.05)。

2.3 宮頸鱗癌及各期別CIN中p16的表達(dá)強(qiáng)度與ki-67指數(shù)間呈正相關(guān)(P1＜0.05，r1=0.92;P2＜0.05，r2=0.96)。

3 討論

CIN是宮頸癌癌前病變，尋找并發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中相關(guān)的敏感指標(biāo)，對阻斷癌前病變的發(fā)展，減少宮頸癌的發(fā)生，幫助臨床工作中早期診斷、早期治療，判斷其轉(zhuǎn)歸，都有著重要的指導(dǎo)意義。

p16基因定位于人第9號染色體短臂2區(qū)1帶(9P21)，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，為周期蛋白依賴激酶抑制劑，是直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑制基因，其蛋白產(chǎn)物p16蛋白為細(xì)胞周期蛋白D/CDK激酶抑制因子，通過與細(xì)胞周期蛋白D(cyclin D1)競爭性結(jié)合CDK4/CDK6，特異性抑制CDK4、CDK6的消化活性，從而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)磷酸化和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子E2F的釋放，形成對CDK4-cyclinD1-Rb-E2F的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，阻斷細(xì)胞由G1期至S期的增殖，引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞癌變〔1～3〕。Salit〔4〕等在研究高危 HPV 感染宮頸鱗癌和p16表達(dá)的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，p16與HPV16/18表達(dá)呈正相關(guān)，提示p16的過度表達(dá)是繼高危HPV感染之后發(fā)生的。

本研究中發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在正常宮頸組織中不表達(dá)，在宮頸癌癌前病變CIN中，隨著CIN級別增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在宮頸癌中過度表達(dá)，說明p16在正常宮頸至CIN，直至最終發(fā)展為宮頸癌的過程中，呈現(xiàn)一個漸進(jìn)表達(dá)過程，與腫瘤細(xì)胞生長失控有密切的關(guān)系，這在其他相關(guān)研究中也得到證實。

ki-67抗原是一種反映細(xì)胞增殖期的核抗原基因，是細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，定位于人第10號染色體，在維持細(xì)胞增殖活性中起著重要作用，ki-67抗原在G0期缺失，在G1、S、G2/M期均有合成，準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖活性，對預(yù)測癌前病變向惡性病變轉(zhuǎn)化有重要的參考價值，對惡性腫瘤的早期診斷、早期治療有指導(dǎo)意義〔5，6〕。

本研究結(jié)果顯示，正常宮頸組織、CIN和宮頸癌組織中的ki-67陽性表達(dá)有顯著差異，表明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。本研究結(jié)果還顯示，宮頸癌及CIN中p16的表達(dá)強(qiáng)度與ki-67指數(shù)間呈現(xiàn)正相關(guān)，通過加快細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

1 Khoo CM，Carrasco DR，Bosenberg MW，et al.Ink4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(10):3931-6.

2 Eleuterio J Jr，Giraldo PC，Goncalves AK，et al.Prognostic markers of high-grade squamous intraepithelial lesions:the role of p16INK4a and high-risk human papillomavirus〔J〕.Acta Obstet Gynecol Scand，2007;86(1):94.

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4 Salit IE，Tinmouth J，Chong S，et al.Screening for HIV-associated anal cancer.correlation of HPV genotypes，P16，and E6 transcripts with anal pathology〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009;18(7):1986-92.

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6 顧依群，高子芳，汪穎南，等.P16INK4A、P53、Ki-67及ER在宮頸病變中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義〔J〕.診斷病理學(xué)雜志，2008;15(2):131.