張衛(wèi)華 高 峰 (鄭州市中牟縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 45450)

視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種自身免疫性疾病〔1〕，患者血清中存在特異性自身免疫性抗體NMO-IgG〔2〕，該抗體能夠與水通道蛋白-4(AQP4)特異性結(jié)合，目前對(duì)該特異性抗體的檢測(cè)已被納入 NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。本研究擬通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)AQP4抗原的HEK293細(xì)胞株，建立以其為底物的間接免疫熒光方法，檢測(cè)NMO患者血清中抗AQP4抗體，并與酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法進(jìn)行比較，為NMO的血清學(xué)診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年Balb/c小鼠由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。菌株 DH5α及HEK293細(xì)胞株購(gòu)自Gibco公司，質(zhì)粒pcDNA3.1為本室保存。血清標(biāo)本取自鄭州大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及眼科2010年1～10月住院患者，其中按照Wingerchuk等制定的NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)(2006年修訂版本)臨床確診NMO患者15例(男4例，女11例，平均41歲)，按照McDonald2005年診斷標(biāo)準(zhǔn)臨床確診典型多發(fā)性硬化患者36例(男21例，女15例，平均34歲)，其他神經(jīng)內(nèi)科及眼科病例30例(男14例，女16例，平均45歲)。對(duì)照血清標(biāo)本由本室提供，均為英國(guó)RSR公司AQP4抗體ELISA檢測(cè)試劑盒重復(fù)檢測(cè)3次后，確定的AQP4抗體陽(yáng)性和陰性血清。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、T4DNA連接酶和RT-PCR試劑為TakaRa公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒為Vegen公司產(chǎn)品，RPMI1640為Gibco產(chǎn)品，Trizol及LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen，兔抗AQP4多克隆抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗人IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司，AQP4自身抗體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自RSR公司。

1.3 AQP4基因的獲取 無(wú)菌狀態(tài)下取健康成年小鼠腦皮質(zhì)，用Trizol試劑提取總RNA，并采用隨機(jī)引物將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照Genebank公布的AQP4序列(U14007)進(jìn)行引物設(shè)計(jì):上 游 引 物:5'-TATCGAATTCATGAGTGACGGAGCTGCAGCGAGGCGGTGG-3';下游引物:5'-TATGCGGCCGCTCATACAGAAGATAATACCTCT-3'。上、下游引物分別含有 EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。電泳鑒定RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI分別對(duì)RT-PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pcDNA3.1進(jìn)行雙酶切，37℃條件下作用1 h。將酶切片段用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，接種到氨芐西林抗性LB平板培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。堿裂解法抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株的建立 將2×105個(gè)HEK293細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80% ～90%，然后按照LipofectamineTM2000的說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1作為對(duì)照組。37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液并加入終濃度為800 μg/ml G418篩選。14 d后，挑取抗藥性克隆至24孔培養(yǎng)板，同時(shí)G418降至維持濃度400 μg/ml，以獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.6 RT-PCR檢測(cè)AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 取篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株采用Trizol試劑分別提取實(shí)驗(yàn)組和空質(zhì)粒對(duì)照組總RNA，然后以RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中AQP4的表達(dá)情況。

1.7 間接免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AQP4的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后篩選得到的HEK293細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞分別接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孔中加有預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片。37℃ 5%CO2進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)50% ～70%時(shí)，取出蓋玻片用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%TritonX-100作用10 min，然后3%H2O2室溫作用5 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，傾除血清，在標(biāo)本上滴加1∶50稀釋的兔抗AQP4多克隆抗體，室溫孵育2 h，pH7.4 PBS沖洗，5 min×3次，滴加 1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，選用藍(lán)色激發(fā)光，陽(yáng)性細(xì)胞顯示綠色熒光。

1.8 檢測(cè)抗AQP4抗體的兩種方法比較 ①間接免疫熒光法:按上述方法，在4%多聚甲醛室溫固定的HEK293細(xì)胞株上滴加1∶50稀釋后的患者血清，室溫孵育2 h，pH7.4 PBS沖洗3次，滴加1∶100稀釋的FITC標(biāo)記山羊抗人IgG，室溫反應(yīng)1 h，pH7.4 PBS沖洗3次，熒光顯微鏡進(jìn)行觀察照相。②ELISA:按操作說(shuō)明書進(jìn)行。分別將25 μl血清標(biāo)本加入預(yù)先包被有AQP4抗原的酶標(biāo)孔中，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。加入25 μl酶標(biāo)二抗室溫振蕩孵育2 h，洗滌3次后加入100 μl底物SA-POD，室溫震蕩孵育20 min，再次洗滌3次后加入100 μl顯色劑TMB于暗處室溫靜置20 min，加入100 μl終止液震蕩5 s終止反應(yīng)，陽(yáng)性標(biāo)本顯示黃色。

2 結(jié)果

2.1 AQP4基因的克隆 小鼠小腦皮質(zhì)總RNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示在993 bp處出現(xiàn)目的條帶，條帶清晰且無(wú)雜帶(圖1)。

圖1 小鼠小腦皮質(zhì)總RNA RT-PCR產(chǎn)物

2.2 重組質(zhì)粒鑒定 pcDNA3.1-AQP4經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切得到5 428和993 bp兩個(gè)DNA片段，其中993 bp片段為與預(yù)期理論值相符的AQP4基因片段(圖2)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)AQP4在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞組擴(kuò)增出一條約993 bp的條帶，與理論值相符合，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組無(wú)目的條帶的出現(xiàn)(圖3)。

2.4 間接免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AQP4的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞，抗原抗體反應(yīng)后熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞表面呈綠色熒光，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞無(wú)熒光表達(dá)(圖4)。

2.5 NMO患者血清AQP4抗體檢測(cè)結(jié)果 ELISA法檢測(cè)15例NMO患者血清AQP4抗體均為陽(yáng)性，其他病例均為陰性。而以本實(shí)驗(yàn)建立的穩(wěn)定細(xì)胞株為底物，用IFA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，15例NMO血清中有14例呈陽(yáng)性反應(yīng)，其他除眼病和腦血管病患者血清各有1例呈陽(yáng)性反應(yīng)外，其余均為陰性。以ELISA檢測(cè)方法作為標(biāo)準(zhǔn)診斷法，IFA法的敏感性為93.3%(14/15)，特異性為97.4%(74/76)，正確指數(shù)為90.7%，假陽(yáng)性率為3.0%，一致性為96.3%。

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AQP4酶切鑒定結(jié)果

圖4 間接免疫熒光檢測(cè)AQP4的表達(dá)(×200)

3 討論

NMO患者體內(nèi)特異性NMO-IgG是能與AQP4結(jié)合的高親和性和高特異性IgG抗體，兩者結(jié)合影響了AQP4的正常功能，并且所形成的免疫復(fù)合物通過(guò)激活補(bǔ)體而導(dǎo)致炎性脫髓鞘、硬化、壞死及血管的透明樣變性〔4〕，從而引發(fā)NMO。目前對(duì)NMO的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)及頭顱、脊髓磁共振成像(MRI)的影像學(xué)指標(biāo)。但該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且易與多發(fā)性硬化相混淆，臨床醫(yī)生較難依據(jù)癥狀準(zhǔn)確進(jìn)行診斷。雖然MRI在NMO的診斷上具有特異性，但早期不易確診，需注意動(dòng)態(tài)觀察，不能一次檢查而定診。NMO患者體內(nèi)特異性NMO-IgG抗體的發(fā)現(xiàn)，為該病的診斷提供了新的方法〔3，5〕。由于NMO-IgG具有高度特異性，可用于鑒別NMO和多發(fā)性硬化〔6〕，且在疾病初期即可通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)到，從而有效減少了誤診和漏診，保證了早診早治，使病人預(yù)后大大改善。因此獲取AQP4抗原是進(jìn)行NMO-IgG抗體檢測(cè)的關(guān)鍵步驟。本研究選擇小鼠作為AQP4基因來(lái)源由于取材于動(dòng)物，且鼠類與人類之間AQP4抗原的差別不會(huì)影響該抗原與NMO病人NMO-IgG抗體結(jié)合〔7〕。

將目的基因?qū)爰?xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株是本實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)，而選擇高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染載體則是重要的前提。本實(shí)驗(yàn)選擇質(zhì)粒pcDNA3.1作為載體，除了該載體是真核表達(dá)載體、具有較為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果，而且還由于該載體含有抗新霉素(NeoR)標(biāo)記基因，可以通過(guò)試劑G418來(lái)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，未被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則無(wú)法存活。本實(shí)驗(yàn)表明真核表達(dá)載體pcDNA3.1-AQP4構(gòu)建成功。所建立的穩(wěn)定表達(dá) AQP4的HEK293細(xì)胞在NMO的臨床診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

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