李繼發(fā) 王世金 郭恒照 (濟(jì)寧市任城區(qū)兗礦集團(tuán)第三醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 707)

2型糖尿病是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，細(xì)胞因子是導(dǎo)致代謝綜合征的主要原因，而炎癥是胰島素抵抗的觸發(fā)因素〔1〕。甚至在亞臨床階段，慢性炎癥就參與了胰島素抵抗綜合征的發(fā)生〔2〕。在整個(gè)炎癥網(wǎng)絡(luò)中，核因子 κB(NF-κB)是研究的熱點(diǎn)之一。NF-κB抑制蛋白(I-κB)激酶/NF-κB炎癥通路活化是導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病的重要機(jī)制之一〔3〕。張冬梅等〔4〕研究表明，藻藍(lán)蛋白在腦缺血損傷中具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用，但其在2型糖尿病病理生理過程中是否具有抗炎作用尚未見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)建立2型糖尿病大鼠，試圖應(yīng)用藻藍(lán)蛋白進(jìn)行干預(yù)，研究其對胰島細(xì)胞功能的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型 健康雄性Wistar大鼠30只，體重120～140 g，由青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動物中心提供〔SCXK(魯)20030010〕。動物均于實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1 w，自由飲食，室溫(23±2)℃，自然光照，相對濕度50% ～70%。隨機(jī)分為對照組、模型組和治療組各10只。對照組10只大鼠喂以普通飼料，其余2組均喂以高糖高脂飼料(15%豬油、20%蔗糖、13%蛋黃粉、2%膽酸鈉、59%普通飼料)，飼養(yǎng)4 w后禁食12 h，以30 mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)檸檬酸緩沖液，對照組大鼠同步注射同劑量的檸檬酸緩沖液。注射4 w后分別剪尾取血，測空腹血糖(FBG)，以血糖值≥7.0 mmol/L視為糖尿病模型建立成功〔5〕，其中16只造模成功。

1.2 干預(yù)措施 糖尿病模型成功后開始干預(yù)治療。藻藍(lán)蛋白粉劑(中國科學(xué)院海洋研究所提供)暗室分裝后－20℃保存，加蒸餾水稀釋至濃度為10%的混懸液，按500 mg/kg體重灌胃，每天1次，連續(xù)10 d。對照組和病模型組同步給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d。

1.3 FBG測定 各組動物分別在造模前、造模后、治療后測定FBG(mmol/L)。測前，大鼠禁食、禁水12 h，次日鼠尾靜脈取血，用自動血糖儀(強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司，穩(wěn)豪型)測定FBG。

1.4 標(biāo)本采集及處理 治療結(jié)束后，各組大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定，取胰腺組織，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5 μm，每隔10片取1片，每個(gè)標(biāo)本取6片，分別裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL試劑盒由武漢博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱1 h，常規(guī)脫蠟，蒸餾水浸泡2 min，按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下細(xì)胞核出現(xiàn)片狀棕黃色顆粒者為陽性著色，即凋亡細(xì)胞。部分切片不加探針，以0.1 mol/L PBS替代染色，不出現(xiàn)陽性著色。在光鏡(400倍)下觀察，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野100個(gè)胰島細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占的百分比的均數(shù)即為凋亡指數(shù)(AI)。

1.6 免疫組化染色 NF-κB p65和I-κB親和純化抗體、即用型SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物公司提供。取上述切片置于60℃烤箱烤片1 h，常規(guī)脫蠟，蒸餾水浸泡2 min，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，光鏡下特異性染色為棕黃色粗顆粒。部分切片不加一抗以0.1 mol/L PBS替代染色，不出現(xiàn)陽性著色。在光鏡(400倍)下觀察，每張切片隨即選擇4個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)胰島細(xì)胞團(tuán)中NF-κB和I-κB的陽性細(xì)胞數(shù)及胰島細(xì)胞的總數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件，計(jì)量資料結(jié)果以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 FBG 造模前各組大鼠FBG無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，造模后大鼠FBG較對照組明顯升高(P＜0.05)。經(jīng)藻藍(lán)蛋白治療后，大鼠FBG較模型組顯著下降(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠FBG比較(，mmol/L)

表1 各組大鼠FBG比較(，mmol/L)

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

造模前 造模后 治療后對照組組別 n 10 3.28±0.43 3.48±0.50 3.91±0.71模型組 8 3.33±0.23 9.15±1.201) 8.94±0.901)治療組 8 3.15±0.31 9.75±1.251) 7.05±0.871)2)

2.2 胰島細(xì)胞凋亡 對照組大鼠胰島可見少量散在的凋亡陽性細(xì)胞，模型組大鼠胰島邊界模糊，陽性細(xì)胞較對照組明顯增多(P＜0.05)，治療組大鼠胰島邊界較清晰，凋亡陽性細(xì)胞較模型組顯著減少(P＜0.05)。見表2和圖1。

表2 各組大鼠胰島細(xì)胞AI、NF-κB和I-κB表達(dá)的比較()

表2 各組大鼠胰島細(xì)胞AI、NF-κB和I-κB表達(dá)的比較()

與對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n AI(%) NF-κB(%) I-κB(%)10 6.00±1.63 15.7±1.83 78.5±2.55模型組 8 20.75±2.501) 38.3±3.811) 31.2±4.801)治療組 8 12.25±2.221)2) 20.6±3.201)2) 58.0±5.261)2)對照組

2.3 NF-κB和I-κB表達(dá) 對照組大鼠胰島細(xì)胞質(zhì)NF-κB表達(dá)較強(qiáng)，顯棕黃色。糖尿病模型組大鼠胰島細(xì)胞核NF-κB表達(dá)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞核呈明顯棕黃色著色，細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色。藻藍(lán)蛋白治療組大鼠胰島細(xì)胞核NF-κB表達(dá)較模型組明顯降低，細(xì)胞核呈淡黃色(圖2和表2)。對照組大鼠胰島細(xì)胞質(zhì)呈深棕黃色著色，細(xì)胞核幾乎不著色。糖尿病模型組大鼠胰島細(xì)胞核、質(zhì)表達(dá)明顯減弱。藻藍(lán)蛋白治療組大鼠胰島細(xì)胞質(zhì)有棕黃色著色，較糖尿病組加深(圖3和表2)。

圖1 各組大鼠胰島凋亡細(xì)胞數(shù)量比較(TUNEL，×400)

圖2 各組大鼠胰島細(xì)胞NF-κB的表達(dá)(SABC，×400)

圖3 各組大鼠胰島細(xì)胞I-κB的表達(dá)(SABC，×400)

3 討論

研究表明，大鼠胰腺是STZ毒性損傷的靶器官，STZ可以通過一氧化氮和自由基等途徑損傷胰島β細(xì)胞誘發(fā)糖尿病〔6〕，而自由基是激活NF-κB的因素之一。由此推測，糖尿病大鼠胰腺中有I-κB/NF-κB通路的活化。本實(shí)驗(yàn)NF-κB免疫組化結(jié)果可見，正常組大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)中胰島細(xì)胞質(zhì)呈明顯棕黃色著色，只局部胰島細(xì)胞核有著色，而糖尿病大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)中胰島細(xì)胞核呈明顯棕黃色著色，細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色。I-κB免疫組化結(jié)果顯示，正常組大鼠胰島細(xì)胞質(zhì)呈深棕黃色著色，細(xì)胞核幾乎不著色，而糖尿病組大鼠胰島細(xì)胞核、質(zhì)幾乎都不著色。這正體現(xiàn)了I-κB被降解后，激活的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移過程。藻藍(lán)蛋白干預(yù)組大鼠NF-κB的免疫組化結(jié)果可見，胰島細(xì)胞核著淡棕黃色，著色程度較糖尿病組明顯減輕。I-κB的免疫組化結(jié)果顯示，藍(lán)藻蛋白干預(yù)組大鼠胰島細(xì)胞質(zhì)有棕黃色著色，著色程度較糖尿病組加深。表明藥物干預(yù)后I-κB的活性可能有所恢復(fù)，NF-κB在胰島細(xì)胞核中的表達(dá)降低。這提示藻藍(lán)蛋白可能具有抑制I-κB/NF-κB通路活化的作用。

長期高血糖使胰島素需求不斷增加，β細(xì)胞處于持續(xù)活化狀態(tài)，一方面削弱胰島β細(xì)胞合成和分泌胰島素的功能，使葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，甚至缺失;另一方面，長期高血糖加速β細(xì)胞凋亡，使有功能的β細(xì)胞數(shù)量減少，兩者共同作用加重了胰島β細(xì)胞功能的衰竭。導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡的因素很多，例如胰淀素、葡萄糖、游離脂肪酸、細(xì)胞因子、一氧化氮、活性氧簇等〔7〕。沙鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著血糖的增高，β細(xì)胞的凋亡頻率逐步上升〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模成功后，大鼠 FBG顯著升高，胰島凋亡細(xì)胞是明顯增多，經(jīng)藻藍(lán)蛋白治療后，大鼠FBG較模型組顯著下降、胰島細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。推測藻藍(lán)蛋白可能作用于胰島β細(xì)胞，保護(hù)胰島β細(xì)胞，減少其凋亡，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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4 張冬梅，劉吉東，陳紅兵，等.藻藍(lán)蛋白對腦缺血再灌注后NF-κB和IL-6表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國海洋藥物，2005;24(1):6-10.

5 郭嘯華，志 紅，李 恒，等.高糖高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型及其腎病特點(diǎn)〔J〕.中國糖尿病雜志，2002;10(2):290-2.

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