陳苗苗 李志潔 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450014)

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其病理特點(diǎn)是嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏液分泌增多和氣道狹窄等。哮喘的機(jī)制十分復(fù)雜，其中Th1與Th2平衡失調(diào)是哮喘的重要發(fā)病機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類I型跨膜蛋白介導(dǎo)的天然免疫模式識(shí)別受體，其中TLR7是其中的重要成員之一。M¨oller-Larsen等〔1〕研究發(fā)現(xiàn)TLR7基因與哮喘密切相關(guān)，TLR7能特異性識(shí)別人工合成的小分子免疫調(diào)節(jié)劑咪喹莫特，識(shí)別后能上調(diào)其表達(dá)并能進(jìn)一步誘導(dǎo)Th1類細(xì)胞因子IL-12、抑制Th2類細(xì)胞因子IL-13的產(chǎn)生，以維持機(jī)體免疫功能的平衡。本文以哮喘小鼠為動(dòng)物模型，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定肺組織中TLR7 mRNA的表達(dá)水平，并測(cè)定肺泡灌洗液中IL-12和IL-13的濃度，旨在探討咪喹莫特治療哮喘的主要作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡清潔級(jí)雌性BALB/C純系小鼠30只，體重15～20 g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 設(shè)備與制劑 咪喹莫特(上海特化醫(yī)藥有限公司)，雞卵白蛋白(OVA，美國(guó)Sigma公司)，小鼠IL-12和IL-13 ELISA試劑盒(美國(guó)R＆D公司)。小鼠TLR7引物序列，上游:cctcaaggctcagaagat，下游:cccactaacaccaccaat。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP、Taq DNA聚合酶、Trans DNA Marker I(北京全式金生物有限公司)，引物(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，低溫冰箱(SANYO公司)，低溫離心機(jī)(Sigma公司)，無菌操作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，酶標(biāo)儀(Multiskan MK3，Thermo Labsystems公司)，PCR儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型建立 SPF級(jí)雌性BALB/C系小鼠30只隨機(jī)分成3組，每組10只。B組(哮喘模型組):小鼠腹腔注射0.1 ml OVA致敏液(含OVA 100 μg和氫氧化鋁凝膠400 μg)，再以相同的劑量和方法在第7天和第14天各致敏一次，21 d后以10 g/L OVA溶液超聲霧化激發(fā)，每天30 min，持續(xù)7 d。C組(咪喹莫特組):在哮喘組的基礎(chǔ)上，在霧化吸入OVA溶液前1 h預(yù)先吸入1.5 g/L咪喹莫特混懸液30 min，連續(xù)7 d。A組(正常對(duì)照組):第0、7、14天給予小鼠腹腔注射生理鹽水0.1 ml，21 d后以生理鹽水溶液超聲霧化激發(fā)，每天30 min，持續(xù) 7 d。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗(BAL)及支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分離與計(jì)數(shù) 在末次激發(fā)后24 h，各組小鼠予以100 g/L水合氯醛溶液400 mg/kg腹腔注射麻醉，立即打開胸腔，在環(huán)狀軟骨上用血管鉗將氣管固定并在其下作一個(gè)橫行切口，置入連接注射器的硅膠管，每次緩慢注入生理鹽水0.4 ml，分3次注入，每次灌洗完后立即回收置于高壓滅菌過的EP管中，計(jì)量，并放于 －4℃冰箱儲(chǔ)存，2 h內(nèi)作細(xì)胞分離。BALF于2 000 r/min離心20 min，細(xì)胞沉淀用0.5 ml PBS液重懸，取0.1 ml在血細(xì)胞技術(shù)臺(tái)測(cè)定細(xì)胞總數(shù);取0.2 ml進(jìn)行涂片，Wright-Giemsa染色，計(jì)數(shù)大于200個(gè)細(xì)胞作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.2.3 三組小鼠BALF中IL-12、IL-13水平檢測(cè) 采用小鼠IL-12、IL-13 ELISA檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)吸光度值計(jì)算出標(biāo)本中所含各因子的含量。

1.2.4 小鼠肺組織病理改變 三組小鼠在末次激發(fā)后24 h，立即打開胸腔，取出左上葉肺組織，用4%中性多聚甲醛固定20 h，石蠟切片后HE染色，顯微鏡下觀察肺組織的炎癥變化。

1.2.5 小鼠肺組織TLR7 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 三組小鼠在末次激發(fā)后24 h，立即打開胸腔，取出右上葉肺組織，凍存，－80℃保存，待提取總RNA進(jìn)行RT-PCR。小鼠肺組織RNA提取按Trizol說明書進(jìn)行操作，RT-PCR條件如下:42℃ RT 30 min，85℃加熱5 min。終止RT反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增預(yù)變性，94℃預(yù)變性2 min，1 個(gè)循環(huán);94℃變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上，在10 V/cm電壓下電泳30 min，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算目的基因和β-actin的DNA條帶灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，數(shù)據(jù)間兩兩比較用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及光鏡觀察肺組織病理改變 正常對(duì)照組小鼠氣道上皮平整，肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出，黏膜下也未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管平滑肌無增厚。哮喘模型組小鼠細(xì)支氣管的管壁增厚，平滑肌增生，可見上皮細(xì)胞脫落、排列紊亂，周圍組織水腫，血管通透性增加，血管和支氣管周圍組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主。咪喹莫特組小鼠炎癥程度較哮喘模型組減輕。見圖1。

2.2 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類 哮喘模型組BALF中細(xì)胞主要由嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞組成，細(xì)胞總數(shù)及各種炎癥細(xì)胞與正常對(duì)照組比較明顯增加;咪喹莫特治療組小鼠中的淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞比哮喘模型組顯著減少。見表1。

表1 三組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞分類比較(n=10，)

表1 三組小鼠BALF總細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞分類比較(n=10，)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與哮喘模型組比較:2)P＜0.05

嗜酸性粒細(xì)胞正常對(duì)照組 1.81±0.172) 89.18±5.432) 2.44±1.82 7.83±0.87 0.53±0.142)組別 細(xì)胞總數(shù)(×106/L)各種炎癥細(xì)胞所占的比例(%)單核細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 中性粒細(xì)胞哮喘模型組 8.86±0.851) 64.25±10.15 5.48±1.01 2.08±0.56 28.27±1.90咪喹莫特組 4.30±0.501)2) 79.38±8.121)2) 2.20±0.321) 8.46±0.66 9.84±1.251)2)

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-12、IL-13水平 哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-12水平較正常對(duì)照組降低，咪喹莫特組小鼠肺泡灌洗液中IL-12水平與哮喘模型組相比升高，但較正常對(duì)照組降低。哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平較正常對(duì)照組升高，咪喹莫特組小鼠肺泡灌洗液中IL-13與哮喘模型組比較降低，但較正常對(duì)照組升高。見表2。

圖1 三組小鼠肺組織病理切片(HE，×200)

表2 ELISA法檢測(cè)三組小鼠BALF中IL-12、IL-13 水平 (pg/ml，n=10，)

表2 ELISA法檢測(cè)三組小鼠BALF中IL-12、IL-13 水平 (pg/ml，n=10，)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與哮喘模型組比較:2)P＜0.01

IL-12 IL-13正常對(duì)照組 27.68±1.192)組別＜0.01 ＜0.01 30.88±1.50哮喘模型組 20.26±2.121) 37.14±1.631)咪喹莫特組 25.23±1.571)2) 32.75±2.452)F值 37.72 27.78 P值

2.4 各組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(dá) 哮喘模型組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(dá)(0.133±0.021)低于正常對(duì)照組(0.239±0.036)，咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(dá)(0.826±0.124)明顯高于哮喘模型組及正常對(duì)照組。見圖2。

圖2 小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(dá)

3 討論

哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，近年來國(guó)內(nèi)外研究表明免疫失衡在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，其中輔助T細(xì)胞(Th)亞群Th1/Th2細(xì)胞失衡是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。Th細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子與哮喘的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切，主要表現(xiàn)在Th1細(xì)胞功能減弱而Th2細(xì)胞功能增強(qiáng)。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-12，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13。IL-12是刺激Th1分化的最有力的細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫應(yīng)答，促使Th0細(xì)胞向Th1分化，并促進(jìn)多種細(xì)胞因子尤其是IFN-γ的分泌，抑制Th2細(xì)胞的功能，減少肺內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，降低氣道的高反應(yīng)性〔3〕。IL-13是一種多效性細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)單粒巨噬細(xì)胞分化并延長(zhǎng)其生存期，參與T、B淋巴細(xì)胞發(fā)育，調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞功能;通過激活嗜酸性粒細(xì)胞，減少其凋亡，促進(jìn)IgE分泌等機(jī)制，在哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用〔4〕。目前調(diào)整Th亞群的平衡成為開發(fā)哮喘治療藥物的重要方向，免疫治療已成為開發(fā)哮喘藥物治療的熱點(diǎn)。

TLR是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞跨膜受體，作為連接天然免疫與特異性免疫的關(guān)鍵元件，在急性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起重要作用，與哮喘炎癥與氣道重塑關(guān)系密切〔5〕。咪喹莫特(Imiquimod)是一種小分子干擾素誘導(dǎo)新型免疫調(diào)節(jié)劑，是Toll樣受體7的特異性配體，主要由巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞所識(shí)別。它和這些細(xì)胞表面的TLR7特異性結(jié)合后，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素和Th1細(xì)胞因子IL-12等的產(chǎn)生〔6〕，抑制 Th2細(xì)胞因子 IL-4和 IL-13等分泌〔7〕，使原始 Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，提示咪喹莫特可能對(duì)治療以Th2反應(yīng)為主的支氣管哮喘有效〔8〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哮喘小鼠支氣管平滑肌增厚，血管和支氣管周圍組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主;哮喘小鼠BALF中的IL-12水平降低而IL-13水平升高;這表明了Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，IL-12生成不足是哮喘發(fā)病的重要原因之一。Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-12減少和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13增多，將會(huì)增加感染呼吸道病毒的機(jī)會(huì)，促使哮喘加重〔9〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示了哮喘小鼠肺組織中的TLR7 mRNA表達(dá)較正常組小鼠減弱，這也證實(shí)了Roponen等〔10〕研究中提到的Toll樣受體7的功能降低增加了患呼吸道疾病如哮喘的機(jī)率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA較哮喘組小鼠表達(dá)增加，進(jìn)一步論證了國(guó)外Jongdae等的研究成果即咪喹莫特可以上調(diào)TLR7基因的表達(dá)〔11〕的觀點(diǎn)。BALF中IL-12水平較哮喘組升高而IL-13降低，有利于Th1反應(yīng)優(yōu)勢(shì)的形成。組織病理學(xué)提示咪喹莫特組小鼠支氣管上皮組織增生及氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較哮喘組顯著減輕，BALF中單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞較哮喘組明顯下降，提示該藥可以在一定程度上減輕哮喘的氣道炎癥?？赡艿臋C(jī)制為:①咪喹莫特與TLR7特異性結(jié)合，通過Toll樣受體7-MyD88依賴的信號(hào)系統(tǒng)誘導(dǎo)NF-κB的活性，促使TLR7 mRNA表達(dá)增加;②增加IL-12的水平，促進(jìn)Th1的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，抑制Th2的體液免疫應(yīng)答，使BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞顯著降低;③降低IL-13的水平，使嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等趨化到炎癥部位受阻，表明了TLR7的配體咪喹莫特對(duì)支氣管哮喘有積極的保護(hù)作用。Du等〔12〕還發(fā)現(xiàn)在哮喘大鼠模型中，TLR7的配體 imiquimod通過降低血清中的IgE和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13來減輕哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。

綜上所述，咪喹莫特在治療支氣管哮喘的實(shí)驗(yàn)研究中，通過上調(diào)TLR7 mRNA表達(dá)，改變Th1/Th2及其細(xì)胞因子的組成，抑制支氣管及肺泡周圍的炎癥細(xì)胞尤其是下調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，即促進(jìn)Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-12，抑制Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-13。因此霧化吸入一定濃度的咪喹莫特可能是治療哮喘的一個(gè)新的免疫治療手段，也為臨床上治療哮喘提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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