于 靜 孫紅霞(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 3203)

心肌纖維化(MF)表現(xiàn)為心室成纖維細(xì)胞(CFb)過度增殖和分泌大量膠原纖維，引起間質(zhì)纖維化并參與心室重塑。近年來文獻(xiàn)報(bào)道，一氧化氮(NO)等生物活性物質(zhì)與MF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。研究還證實(shí)氧化還原反應(yīng)參與了 MF的形成〔2〕。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSN)是常用的活血化瘀中藥丹參的提取物，具有抑制CFb增殖和間質(zhì)纖維蛋白分泌作用〔3〕。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上觀察 TSN對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)CFb增殖，以及對(duì)羥脯氨酸(Hyp)、NO水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響，探討其抑制MF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞 TSN(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，編號(hào)110766-200416);胰蛋白酶，寶泰克生物試劑;AngⅡ、四氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶均為Sigma公司產(chǎn)品;NO試劑盒為南京建成生物技術(shù)公司產(chǎn)品;IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone Utah公司;胎牛血清(FCS)，杭州四季青;Heraeus型CO2培養(yǎng)箱;SUNRISE TECAN FO39300型自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀(澳大利亞);EPICS-ProfileⅡ型流式細(xì)胞分析儀。日本Olympus倒置顯微鏡;超凈工作臺(tái)。出生1～3 d的Wistar大鼠心室，胰酶消化，收集細(xì)胞，置于含100 ml/L FCS的IMDM培養(yǎng)液中，在50 ml/L CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)60～90 min。采用差速貼壁法分離CFb，加入含100 ml/L FCS的IMDM繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)倒置顯微鏡、透射電鏡、免疫組化纖維黏連蛋白染色陽性和平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性鑒定為所需的CFb，純度達(dá)98%，生長(zhǎng)近融合時(shí)按1∶3傳代，實(shí)驗(yàn)采用2～4代細(xì)胞。

1.2 分組 分5組，對(duì)照組:含有IMDM的培養(yǎng)液;AngⅡ組:培養(yǎng)液中加入終濃度為10－7mol/L的AngⅡ;TSN組1:培養(yǎng)液中同時(shí)加入10－7mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ;TSN組2:培養(yǎng)液中同時(shí)加入10－6mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ;TSN組3:培養(yǎng)液中同時(shí)加入10－5mol/L TSN和10－7mol/L AngⅡ。

1.3 MTT比色法測(cè)定CFb的增殖活力 各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組細(xì)胞9復(fù)孔，各處理組作用36 h。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入5 g/L MTT 10 μl，待形成藍(lán)紫色的結(jié)晶沉淀后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl使沉淀降解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(A值)，用只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.4 Hyp法檢測(cè)心室中膠原含量 各處理組作用36 h，按照南京建成生物工程研究所提供的藥盒及說明測(cè)定Hyp含量，所得值/0.134即為心肌中膠原蛋白的含量。

1.5 NO活性測(cè)定 10－5mol/L TSN劑量組分別作用24、36、48、60 h。采用硝酸還原酶法測(cè)定NO，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO2－含量，通過顯色深淺讀取吸光度。樣品NO含量按公式〔(測(cè)定管吸光度－空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－空白管吸光度)×100 μmol/L〕計(jì)算。

1.6 比色法測(cè)定CFb中SOD活性和MDA含量 各處理組作用24 h，取100 μl上清液，532 nm 處，1 cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，按照試劑盒說明操作，測(cè)各管吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察CFb生長(zhǎng)形態(tài)變化 各處理組作用36 h后，放置在倒置顯微鏡下觀察CFb形態(tài)變化。對(duì)照組胞質(zhì)豐富，細(xì)胞呈梭型且連接豐富;AngⅡ組CFb增生呈火焰狀，細(xì)胞生長(zhǎng)密集;TSN組細(xì)胞密度明顯降低，間隙逐漸增大。見圖1。

2.2 MTT法檢測(cè)CFb的增殖活力 AngⅡ能夠明顯提高CFb對(duì)MTT的代謝率，MTT值明顯升高，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，說明AngⅡ?qū)Fb有促增殖作用。加入不同劑量的TSN后，MTT值明顯低于AngⅡ組，有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，且此抑制作用具有劑量依賴性。見表1。

2.3 Hyp法測(cè)定CFb膠原含量 AngⅡ組膠原含量升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05);TSN作用后，呈明顯的量效依賴性膠原含量下降，與AngⅡ組相比有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

2.4 CFb培養(yǎng)液中NO系統(tǒng)活性測(cè)定 AngⅡ組NO水平明顯減少，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05，P＜0.01);TSN可呈時(shí)間依賴性升高CFb中NO含量，與AngⅡ組相比差異顯著(P＜0.05)或非常顯著(P＜0.01);TSN 60 h組與TSN 24 h組相比差異非常顯著(P＜0.01)。見圖2。

2.5 CFb中SOD活性和MDA含量 與對(duì)照組相比，AngⅡ組SOD值明顯減少(P＜0.05)，MDA顯著升高(P＜0.01)，TSN各劑量組可不同程度地升高SOD活性，降低MDA含量，與AngⅡ組相比差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

表1 各組細(xì)胞增殖活力(OD值)及膠原含量(，n=8)

表1 各組細(xì)胞增殖活力(OD值)及膠原含量(，n=8)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與AngⅡ組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 OD值 膠原(μg/mg)0.298 9±0.042 3 1.74±0.34 AngⅡ組 0.360 0±0.024 31) 2.91±0.271)AngⅡ +TSN 10－7組 0.268 2±0.032 82) 1.40±0.432)AngⅡ +TSN 10－6組 0.220 7±0.035 72) 1.26±0.422)AngⅡ +TSN 10－5組 0.180 8±0.062 53) 1.08±0.373)對(duì)照組

表2 各組SOD活性及MDA含量比較(，n=6)

表2 各組SOD活性及MDA含量比較(，n=6)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與AngⅡ組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)19.17±3.32 2.06±0.71 AngⅡ組 13.60±2.271) 7.06±1.642)AngⅡ +TSN 10－7組 15.61±2.143) 5.97±1.283)AngⅡ +TSN 10－6組 16.50±3.733) 5.88±1.093)AngⅡ +TSN 10－5組 17.17±2.664) 4.71±1.124)對(duì)照組

圖1 各組CFb生長(zhǎng)形態(tài)變化(×200)

圖2 各組細(xì)胞作用不同時(shí)間NO含量比較

3 討論

高血壓、心肌梗死、糖尿病等多種疾病可引起CFb增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量合成與分泌，沉積于心臟間質(zhì)部位，產(chǎn)生MF，導(dǎo)致心功能嚴(yán)重受損〔4〕。因此調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖及分化可能是防治MF、改善心臟病預(yù)后的關(guān)鍵措施之一〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予TSN后，可使AngⅡ作用下的CFb MTT-OD值顯著降低，膠原蛋白含量下降。

在調(diào)節(jié)MF的生物活性因子中，NO受到重視。心肌局部?jī)?nèi)皮素、NO等生物活性因子是心肌間質(zhì)CFb增生和MF的重要中介因子〔6〕。心血管系統(tǒng)中，NO除可抑制心肌細(xì)胞凋亡〔7〕，還與心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系〔8〕。在體研究證實(shí)，NO生成不足可加速由AngⅡ持續(xù)輸注引起的纖維化，并使其加重〔9〕。近年來研究顯示，內(nèi)源性的NO可通過自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFb增殖和膠原合成，降低細(xì)胞外膠原沉積，其生成增加可拮抗AngⅡ所致的MF，延緩并逆轉(zhuǎn)心室肥厚，改善心肌纖維化〔10〕。TSNⅡA是丹參的重要心血管活性成分，具有改善微循環(huán)、抗缺氧、抗缺血作用〔11〕，但TSN作用下的CFb NO活性變化及其與MF的關(guān)系報(bào)道不多。有資料顯示，正常大鼠的CFb能夠分泌一定量的NO〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AngⅡ組NO水平明顯下降，用藥后TSN各劑量組NO水平升高，與AngⅡ組相比差異顯著，且NO水平隨TSN作用時(shí)間增加而升高，呈明顯的時(shí)間依賴性。

近幾年的研究顯示，氧化應(yīng)激反應(yīng)參與心室重構(gòu)〔2〕，AngⅡ可作為一種內(nèi)在的氧化劑，促使氧化應(yīng)激的發(fā)生，在高血壓、糖尿病等疾病引起的心臟損害中發(fā)揮重要作用〔13〕。Nakagami等〔14〕用AngⅡ誘導(dǎo)新生鼠心肌細(xì)胞肥大，研究發(fā)現(xiàn)肥厚反應(yīng)由介導(dǎo)，抗氧化劑能減輕氧化應(yīng)激，所有反應(yīng)可被AT1R阻斷劑所阻斷。提示AngⅡ與AT1R結(jié)合后，可激活還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶產(chǎn)生，同時(shí)體內(nèi)SOD、GSH-Px等抗氧化系統(tǒng)清除氧自由基能力減弱，導(dǎo)致氧自由基堆積。本文結(jié)果表明，AngⅡ組SOD活性明顯降低，MDA水平明顯升高，與對(duì)照組相比差異顯著。TSN干預(yù)組能顯著提高SOD活性、降低MDA水平，說明TSN通過其抗氧化作用抑制AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制MF的發(fā)生。

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