谷莉娜 鄭 楊 王奭驥 谷鐵軍 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 3002)

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)，又稱細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是指細(xì)胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與心肌梗死心肌細(xì)胞的死亡，并在心室重構(gòu)、心功能改變過程中起關(guān)鍵作用〔1〕。本研究觀察高壓氧預(yù)處理對正常和糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并檢測正常和糖尿病大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 75只健康成年雄性Wistar大鼠，體重250～350 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 儀器及試劑 動物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司);BL-420生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);電子天平ESJ60-4(沈陽龍騰電子有限公司);電子天平HX5CC1(慈溪市天東衡器廠);灌流液濾過裝置(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)院);Langerdorff離體灌流裝置(沈陽國藥集團(tuán)定制);光學(xué)顯微鏡BX51(日本OLYMPUS公司 );石蠟切片機(jī)RM 2245(德國LEICA公司);免疫組化檢測試劑盒和Bcl-2、BaX抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 2型糖尿病(T2DM)動物模型建模方法 取45只成年雄性Wistar大鼠高脂飼料(88.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%豬油和0.2%膽鹽)飼養(yǎng)1個月后給予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病模型成功。大鼠繼續(xù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)2個月。

1.3.2 分組及干預(yù) 將75只大鼠分為正常組(30只)和糖尿病組(45只)。正常組分為正常對照組(N-C組，n=10):以KH液持續(xù)灌流120 min;正常缺血-再灌注組(N-I/R組，n=10):以K-H液穩(wěn)定灌流 20 min后，停止灌流 30 min，再灌注120 min;正常高壓氧預(yù)處理組(N-P組，n=10):該組大鼠經(jīng)過高壓氧預(yù)處理后，其余實(shí)驗(yàn)方法同I/R組。造模成功的T2DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM-C組，n=10):以K-H液持續(xù)灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注組(DM-I/R組，n=10):以KH液穩(wěn)定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高壓氧預(yù)處理組(DM-P組，n=10):該組大鼠經(jīng)過高壓氧預(yù)處理后，其余實(shí)驗(yàn)方法同I/R組。高壓氧預(yù)處理的方法:每天先洗艙，以保證艙內(nèi)處于純氧狀態(tài)。然后將大鼠放進(jìn)動物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)，以0.2 ATA/min注入純氧，至壓力達(dá)到2.0 ATA(標(biāo)準(zhǔn)大氣壓)。當(dāng)壓力穩(wěn)定后，將大鼠放置60 min。達(dá)到規(guī)定時間后，以0.2 ATA/min排放艙內(nèi)氧氣，至艙內(nèi)壓力恢復(fù)至正常。1次/d，共7 d。

1.3.3 離體大鼠心臟灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒溫恒壓條件下，從主動脈根部用氧飽和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注關(guān)閉了主動脈瓣，類似于在體心臟處于舒張期，停止灌流即模擬全心缺血狀態(tài)，恢復(fù)灌流即全心再灌注開始。具體步驟:取大鼠，秤體重，按5 ml/kg給予20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，置于動物臺上，固定四肢。迅速開胸取出心臟并立即置于4℃ K-H緩沖液中，輕輕擠壓心室，使心腔中殘余血排除。開啟Langendorff灌流裝置，流量約10 ml/min于液面下在1 min內(nèi)迅速把主動脈接于灌流的套管上，將大鼠心臟懸掛于Langendorff裝置上，并以絲線結(jié)扎固定。用95%O2～5%CO2平衡的37℃ K-H液行主動脈逆行恒壓灌流，灌流壓力為80 cmH2O。剪去左心耳，將帶有水囊的壓力換能器(事先應(yīng)排盡空氣)通過左心房插入左心室。壓力換能器的另一端接于BL-420生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，由其記錄血流動力學(xué)變化。

1.3.4 標(biāo)本制備 灌流畢，速取心臟于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，每隔1 mm橫斷面切數(shù)張4 μm厚的切片，分別做HE染色、心肌細(xì)胞凋亡、Bax與Bcl-2表達(dá)檢測。

1.3.5 TUNEL法原位檢測心肌細(xì)胞凋亡 取各組心肌細(xì)胞切片放入4%甲醛溶液固定，按TUNEL試劑盒說明書原位檢測凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈黃褐色為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機(jī)計數(shù)5個以上視野，分別計算每個視野細(xì)胞核數(shù)及凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)，根據(jù)如下方法計算凋亡指數(shù)(AI)，AI(%)=凋亡陽性的細(xì)胞核數(shù)/總計數(shù)的細(xì)胞核×100%。

1.3.6 采用免疫組化法檢測Bcl-2與Bax表達(dá) 利用圖形分析系統(tǒng)分別對細(xì)胞凋亡和Bcl-2與Bax陽性細(xì)胞灰度值進(jìn)行測定，求取每個視野均值代表該切片的測量值，以表示其染色強(qiáng)度。平均灰度值與陽性細(xì)胞表達(dá)成反比，平均灰度值越高，表示指標(biāo)的陽性染色數(shù)量越少;平均灰度值越低，表示指標(biāo)的陽性染色數(shù)量越多。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理學(xué)分析 圖1可見，染色見正常對照組大鼠心臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，心肌細(xì)胞排列整齊略松散，偶見炎細(xì)胞浸潤。正常缺血-再灌注組:心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞腫脹可見心肌細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，有大量炎細(xì)胞浸潤;正常高壓氧預(yù)處理組:心肌細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞略腫脹，可見心肌細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，有少量炎細(xì)胞浸潤，病變較正常缺血再灌注組輕;糖尿病大鼠對照組見心臟結(jié)構(gòu)完整、清晰，心肌細(xì)胞排列較為整齊，偶見炎細(xì)胞浸潤及胞質(zhì)嗜酸性略增強(qiáng);糖尿病大鼠缺血-再灌注組見心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞腫脹可見心肌細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，有大量炎細(xì)胞浸潤;糖尿病高壓氧預(yù)處理組見心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞腫脹可見心肌細(xì)胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，有少量炎細(xì)胞浸潤，病變較糖尿病缺血再灌注組輕。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡變化 圖2可見，正常及糖尿病對照組均可見少量陽性凋亡細(xì)胞;正常及糖尿病缺血-再灌注組心肌細(xì)胞凋亡均明顯增多，但糖尿病缺血-再灌注組比正常缺血-再灌注組凋亡增多更明顯;正常及糖尿病高壓氧預(yù)處理組仍可見較多凋亡細(xì)胞，但比缺血-再灌注組明顯減少，其中正常大鼠高壓氧預(yù)處理組凋亡細(xì)胞減少更明顯。見表1。

圖1 心肌組織病理學(xué)分析(HE，×200)

圖2 心肌細(xì)胞凋亡變化(TUNEL染色，×200)

表1 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(，%)

表1 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(，%)

與N-C組比較:1)P＜0.05;與N-I/R組比較:2)P＜0.05;與DM-C組比較:3)P＜0.05;與DM-I/R組比較:4)P＜0.05，下表同

10 5.0±0.98 N-I/R組 10 41.72±3.471)N-P組 10 33.15±4.362)DM-C組 10 8.56±2.33 DM-I/R組 10 52.73±6.713)DM-P組 10 41.69±5.794)凋亡指數(shù)N-C組組別 n

2.3 心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)水平 正常及糖尿病缺血-再灌注組Bcl-2的表達(dá)均明顯減少，Bax的表達(dá)均明顯增多，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但糖尿病組更為明顯;正常及糖尿病高壓氧預(yù)處理組Bcl-2的表達(dá)均明顯增多，Bax的表達(dá)均明顯減少，與缺血-再灌注組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但正常組更明顯。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)的平均灰度比較(，n=10)

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達(dá)的平均灰度比較(，n=10)

127±9.12 177.67±4.59 N-I/R組 171.83±8.661) 157.50±8.121)N-P組 158.67±7.692) 170.17±7.352)DM-C組 150.33±7.65 149.33±7.94 DM-I/R組 183.33±9.153) 134.0±4.733)DM-P組 166.0±10.534) 141.17±6.774)Bcl-2 Bax N-C組組別

3 討論

糖尿病是冠心病的主要危險因素，急性心肌梗死糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。已發(fā)現(xiàn)，在糖尿病損傷的心肌組織中存在著大量的凋亡細(xì)胞〔2，3〕，心肌細(xì)胞凋亡可能是心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的關(guān)鍵因素。Bcl-2和Bax基因是調(diào)控凋亡的主要基因，Bcl-2基因是一原癌基因，能抑制細(xì)胞凋亡，其過量表達(dá)可阻斷因缺血、細(xì)胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、cmyc等不同刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2抑制凋亡的機(jī)制是它可直接或間接地阻止細(xì)胞色素自線粒體的釋出，而后者可與ATP一起改變Apaf-1的構(gòu)型而使caspase-9激活。Bax基因?yàn)榇龠M(jìn)凋亡基因，主要表達(dá)于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Bax與Bcl-2有很高的同源性，能與Bcl-2形成異源二聚體，通過抑制后者的活性，使凋亡易于發(fā)生。Bcl-2和Bax的表達(dá)程度決定了細(xì)胞命運(yùn)，Bcl-2占優(yōu)勢時阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，而Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞趨向凋亡。

人們把超過1個大氣壓的壓力稱高氣壓。在高氣壓環(huán)境中吸入高濃度氧或純氧，使氧壓或氧分壓大于常壓純氧水平的氧，即稱為高壓氧。高壓氧條件下可使物理溶解氧量顯著增多，可使局部血管擴(kuò)張，增加該地區(qū)的血流量，可明顯改善缺血、缺氧組織血供，增強(qiáng)微循環(huán)功能。高壓氧作用下氧的有效彌散半徑加大，彌散深度和范圍增加，這就使得在一般常壓下無法深達(dá)的組織細(xì)胞可獲得足夠的氧的供應(yīng)，增加組織儲氧量，糾正缺氧。因此高壓氧廣泛應(yīng)用于治療缺血缺氧性疾病。研究表明〔4～7〕，高壓氧預(yù)處理可減輕大鼠的心肌缺血-再灌注損傷。但高壓氧預(yù)處理對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，特別是對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響至今未見報道。

本實(shí)驗(yàn)利用離體灌流模型觀察高壓氧預(yù)處理對正常和糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。本實(shí)驗(yàn)表明正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注組與對照組相比心肌細(xì)胞凋亡明顯增多，Bcl-2的表達(dá)明顯減少，Bax的表達(dá)明顯增多，其中糖尿病缺血-再灌注組心肌細(xì)胞凋亡比正常大鼠缺血-再灌注組心肌細(xì)胞凋亡更為明顯，給予高壓氧預(yù)處理后正常及糖尿病大鼠凋亡細(xì)胞均明顯減少，Bcl-2的表達(dá)明顯增多，Bax的表達(dá)明顯減少，與缺血-再灌注組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。說明高壓氧預(yù)處理可減輕正常及糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，對正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注心肌細(xì)胞均具有保護(hù)作用，其中對正常大鼠的保護(hù)作用更強(qiáng)。關(guān)于高壓氧預(yù)處理如何實(shí)現(xiàn)其抗細(xì)胞凋亡，涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及行高壓氧預(yù)處理的最佳療程尚有待進(jìn)一步研究。

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