楊明花 王 帥 田 昕 李 妍 隋承光 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤研究所,遼寧 沈陽(yáng) 110001)
前列腺癌在歐美國(guó)家是最常見的男性惡性腫瘤之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),2008年美國(guó)有28 660人死于前列腺癌,同時(shí)有186 320例新增病例〔1〕,我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也呈明顯上升的趨勢(shì),尤其在老年男性人群中發(fā)病率較高〔2〕。前列腺特異膜抗原(PSMA)是一種較前列腺特異性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)更加敏感和特異的前列腺癌(PCa)腫瘤標(biāo)記物,已成為前列腺癌研究中的熱點(diǎn)之一〔3〕。PSMA是存在于前列腺腺上皮細(xì)胞胞膜的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,在前列腺癌基因治療中具有良好的靶向性〔4〕。重組復(fù)制缺陷型腺病毒作為基因治療和蛋白表達(dá)載體,已成為基因免疫治療研究中最為廣泛的載體之一。本實(shí)驗(yàn)通過腺病毒 Adxsi系統(tǒng)構(gòu)建一種能高效表達(dá)人類PSMA基因的重組腺病毒,為下一步研究用其制備樹突細(xì)胞疫苗治療前列腺癌奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料 pCMV-SPORT6/PSMA質(zhì)粒、pShuttle-CMV-EGFP穿梭質(zhì)粒和pAdxsi腺病毒骨架質(zhì)粒均由本室保存,所用限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自New England Biolabs公司;T4 DNA連接酶購(gòu)自晶美生物公司;CIP(Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal)酶購(gòu)自promega公司;pfx DNA聚合酶購(gòu)自Invitrogen公司;dNTP購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;引物合成于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒 (柱離心型)均購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;1 kb DNA ladder購(gòu)自鼎國(guó)生物公司;DNA Marker DL2000為大連寶生物的TAKARA產(chǎn)品,兔抗人PSMA單克隆抗體購(gòu)自Epitomics公司;羊抗兔二抗購(gòu)自中杉公司;兔抗人β-actin多克隆抗體購(gòu)自康為世紀(jì)公司。大腸桿菌DH5α超級(jí)化學(xué)感受態(tài),HEK293細(xì)胞由本室保存。
1.2 方法
1.2.1 PSMA基因片段的克隆 參照PSMA序列設(shè)計(jì)一對(duì)上下游中均含有SfiⅠ酶切位點(diǎn)的引物,以pCMV-SPORT6/PSMA為模板,高保真酶(pfx DNA ploymerase)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,獲得PSMA基因片段。
1.2.2 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將回收后的PSMA基因片段和腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP均用SfiⅠ酶切,瓊脂糖凝膠電泳后,柱離心型DNA純化試劑盒回收獲得的約2.2 kb的PSMA基因片段和5.1 kb的載體DNA片段。以分子濃度比為3∶1比例,將回收后的PSMA基因與載體DNA片段用T4 DNA連接酶,于22℃下連接4 h,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH5 α,接種卡那霉素平板培養(yǎng)過夜,挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng),質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒純化質(zhì)粒,獲得重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA。分別對(duì)重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進(jìn)行SfiⅠ酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定有無PSMA基因片段。為確保重組質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA中插入序列及讀碼框架的正確性,送交上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定。
1.2.3 重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA的構(gòu)建及鑒定 用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-PSMA,跑膠回收含目的基因的片段,同時(shí)用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理pAdxsi載體,并做CIP去磷酸化處理,乙醇沉淀法回收載體,將處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,取3 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5α菌株,涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基平皿,挑取若干陽(yáng)性克隆菌落,接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜,質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒純化質(zhì)粒,獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA。同法制備不含目的基因的對(duì)照重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP。用XhoI酶分別對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進(jìn)行酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,觀察重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建是否正確。
1.2.4 重組人PSMA腺病毒的包裝、擴(kuò)增及純化 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞,待細(xì)胞融合至80% ~90%時(shí)轉(zhuǎn)染重組腺病毒。將鑒定正確的攜帶PSMA基因的腺病毒質(zhì)粒用PacI限制性內(nèi)切酶線性化,Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293包裝細(xì)胞,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,7~12 d后可觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),并可在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),收集細(xì)胞,離心后棄上清,用1 ml PBS重懸細(xì)胞,-80℃、37℃反復(fù)凍融3次,離心,收集病毒上清液。取40% ~50%上清液重新感染80%~90%的HEK 293細(xì)胞,以相同的方法反復(fù)凍融4次,收上清液,用CsCl密度梯度離心法純化病毒,分裝成小份,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 重組腺病毒質(zhì)粒的提取鑒定及滴度測(cè)定 取重組病毒上清 10 μl,加 2 μl蛋白酶 K(10 mg/ml),50℃孵育 1 h,100 ℃煮沸5 min,離心后取上清2 μl做模板,PCR鑒定重組病毒。將HEK293細(xì)胞平鋪于96孔板,將濃縮后的病毒貯存液按不同的稀釋倍數(shù)稀釋,加至293細(xì)胞培養(yǎng)孔中,于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,第10天于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算每行出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的孔數(shù)和陽(yáng)性孔的比率。按照TCID50法〔5〕的計(jì)算公式,對(duì)于100 μl樣品,滴度T=101+d(s-0.5),式中d=log10稀釋度;s=各稀釋度陽(yáng)性孔的比率之和。將TCID50/ml轉(zhuǎn)換成 pfu/ml,按以下公式計(jì)算:T=a ×10bTCID50/ml=a×10b-0.7pfu/ml。
1.2.6 PSMA蛋白的表達(dá) 將HEK293細(xì)胞按6×106/ml接種75 cm2培養(yǎng)瓶,細(xì)胞密度60% ~80%時(shí),將病毒上清液以感染復(fù)數(shù)(MOI)200感染細(xì)胞,48 h熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)〔6〕。同時(shí),用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉后,加入抗PSMA單克隆抗體和羊抗兔二抗分別按1∶2 000和1∶5 000稀釋使用?;瘜W(xué)發(fā)光法顯色。
2.1 pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒的鑒定 分別對(duì)重組pShuttle-GFP-PSMA穿梭質(zhì)粒和空載體pShuttle-CMV-EGFP進(jìn)行SfiⅠ酶切,PCR擴(kuò)增鑒定,前者得到約2.2 kb和5.1 kb的兩個(gè)條帶,與插入的目的片段大小相一致,見圖1。后者陰性克隆得到5.1 kb一條帶即重組穿梭載體片段。測(cè)序鑒定后的結(jié)果與GenBank報(bào)道一致。
圖1 pShuttle-GFP-PSMA鑒定結(jié)果
2.2 重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA的鑒定 用XhoI酶分別對(duì)重組腺病毒質(zhì)粒pAdxsi-GFP-PSMA和空載體pAdxsi-GFP進(jìn)行酶切,酶切完成后加樣至1%的瓊脂糖凝膠,電泳,陽(yáng)性克隆有 7 條帶:14 kb、11.8 kb、4.8 kb、2.66 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb,空載體有 6 條帶:14 kb、11.8 kb、4.0 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.6 kb。見圖 2 和圖 3。
圖2 pAdxsi-GFP-PSMA酶切電泳結(jié)果
圖3 pAdxsi空載體酶切電泳結(jié)果
2.3 重組人PSMA腺病毒的產(chǎn)生及鑒定 用PacⅠ線性化的pAdxsi-GFP-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,培養(yǎng)1 w后出現(xiàn)細(xì)胞呈空泡樣病變,在熒光顯微鏡下見明顯細(xì)胞病理效應(yīng)時(shí),提取病毒DNA,經(jīng)PCR反應(yīng),電泳見2 200 bp大小目的條帶。見圖4。說明目的基因已重組到腺病毒基因組上。將鑒定正確的濃縮病毒液以不同比例稀釋重感染HEK 293細(xì)胞,計(jì)算病毒滴度為2.0×1010pfu/ml。
2.4 重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的Western印跡測(cè)定 Ad-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,48 h后熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性表達(dá)率約達(dá)90%。Western印跡顯示,在相對(duì)分子質(zhì)量100 kD有一條帶,與PSMA大小基本相符(糖基化作用使其相對(duì)分子質(zhì)量略大于氨基酸理論值81 kD),而對(duì)照Ad未見PSMA表達(dá)條帶。見圖5,圖6。
圖4 重組純化腺病毒PCR電泳圖
圖5 重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的Western印跡結(jié)果
圖6 Ad-GFP-PSMA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后結(jié)果(×100)
PSMA是由前列腺上皮細(xì)胞分泌的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白,含有750個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量約為100 000。PSMA由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,分別為含19個(gè)氨基酸的胞內(nèi)N-末端區(qū)、24個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和707個(gè)氨基酸的胞外區(qū),其胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)有多個(gè)表位,可與多種單克隆抗體結(jié)合。與表位結(jié)合的抗體、特別是與胞外區(qū)表位結(jié)合的抗體在前列腺癌的診斷和治療中具有重要價(jià)值。PSMA在前列腺組織、前列腺癌及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、骨轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)呈陽(yáng)性,并且僅上皮細(xì)胞呈陽(yáng)性,基質(zhì)細(xì)胞則為陰性;其他組織幾乎無表達(dá)〔7,8〕。PSMA在癌組織中表達(dá)強(qiáng)度較高,其表達(dá)水平與病情進(jìn)展有明顯相關(guān)性,發(fā)生轉(zhuǎn)移、對(duì)激素治療不敏感的Gleason評(píng)分較高的病例表達(dá)水平明顯高于病情穩(wěn)定的病例〔9〕;而前列腺癌去勢(shì)治療后有55%的原發(fā)灶PSMA表達(dá)增加,繼發(fā)灶則100%表達(dá)增加。因而可以認(rèn)為,對(duì)于前列腺癌尤其是惡性程度較高、激素治療不敏感和轉(zhuǎn)移癌,PSMA是一種有效的基因治療靶位〔10,11〕。本文據(jù)此構(gòu)建了含PSMA基因序列的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。
腺病毒在腫瘤基因治療中有很好的治療效果和應(yīng)用前景,具有諸多優(yōu)勢(shì):①腺病毒不僅能高效感染多種增殖細(xì)胞,也能感染靜息細(xì)胞;②不與細(xì)胞的基因組發(fā)生整合,不引起基因突變,并可攜帶較大片段的外源基因;③其感染宿主范圍廣,對(duì)人致病性低;④感染宿主細(xì)胞后表達(dá)的目的抗原,較質(zhì)粒載體易獲得更強(qiáng)的免疫應(yīng)答〔12〕。因此,腺病毒成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒后被廣泛應(yīng)用于基因免疫治療的一種比較理想的表達(dá)載體。我們選用Adxsi系統(tǒng),該系統(tǒng)由穿梭質(zhì)粒載體系統(tǒng),病毒骨架載體,及包裝細(xì)胞系HEK293構(gòu)成,其中pAdxsi骨架質(zhì)粒是攜帶5型腺病毒基因組(去掉了E1區(qū)和E3區(qū)),所以該系統(tǒng)構(gòu)建的腺病毒載體屬于復(fù)制缺陷型腺病毒載體。該系統(tǒng)采用直接連接的方案進(jìn)行穿梭載體與病毒骨架質(zhì)粒的重組。直接連接的方案采用I-Ceul及I-Scel雙酶切位點(diǎn)定向克隆,采用這兩個(gè)酶切位點(diǎn)的好處是識(shí)別序列非常長(zhǎng),在人的基因組內(nèi)幾乎沒有任何這兩個(gè)酶切位點(diǎn)。Adxsi系統(tǒng)的最大優(yōu)勢(shì)是病毒包裝穩(wěn)定,病毒滴度高,可以包裝有細(xì)胞毒性的基因,也可以包裝干擾腺病毒生理過程(感染、復(fù)制、包裝等過程)的基因。本實(shí)驗(yàn)中,Adxsi系統(tǒng)通過控制PSMA基因在包裝細(xì)胞系中表達(dá)從而提高了腺病毒包裝的成功率,同時(shí)也大大提高了腺病毒的滴度。大量擴(kuò)增后我們用CsCl純化法,去除有缺陷的病毒顆粒、細(xì)胞碎片和少量培養(yǎng)基成分,最大限度的降低這些污染誘導(dǎo)的免疫學(xué)反應(yīng)〔13,14〕,制備出高滴度(2 ×1010pfu/ml),高產(chǎn)量的攜帶PSMA基因的重組腺病毒。
為了解攜帶人PSMA基因的重組腺病毒能否表達(dá),本研究將包裝的病毒感染HEK293細(xì)胞后,通過熒光倒置顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。以病毒裂解液為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)也證實(shí)病毒基因組中含有PSMA的基因片段。同時(shí)收集轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞,進(jìn)行Western印跡鑒定,能見大小基本正確的目的蛋白條帶。我們成功地制備了表達(dá)人類PSMA基因的重組腺病毒,這一初步結(jié)果為進(jìn)一步研究用其制備樹突細(xì)胞疫苗治療前列腺癌打下基礎(chǔ)。
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