顧瓊瓊 劉向群 王 敏 于 昕 (山東大學(xué)齊魯醫(yī)院干部保健科，山東 濟(jì)南 250012)

動脈粥樣硬化(AS)及其并發(fā)癥是心腦血管疾病的重要病理生理基礎(chǔ)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。近年來的研究顯示，AS是一種多因素疾病，炎癥貫穿于動脈硬化發(fā)展的整個過程，是動脈硬化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，炎癥因子在AS發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用〔1，2〕。黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，具有抗炎、抑制血管平滑肌的增殖 、脂氧化酶及抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用，從理論上來講其可作為預(yù)防AS的有效天然藥物應(yīng)用。本研究通過觀察黃芩苷對AS大鼠血漿凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)、高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及白介素(IL)-6水平的影響，探討黃芩苷在干預(yù)AS發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器 健康雄性的Wistar大鼠，8周齡，體重300～400 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。黃芩苷:黃色粉末，購自四川協(xié)力制藥有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字20053191，相對分子質(zhì)量為446.35，臨用時用生理鹽水配制成25 mg/ml，于棕色容器中密閉儲存。酶標(biāo)儀:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室提供(Model 550型，美國 BIO-RAD公司生產(chǎn))。大鼠hs-CRP、IL-6酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒購自美國R＆D公司。TAFI發(fā)色底物試劑盒為美國DIAGNOSTICA公司生產(chǎn)，購自上海船夫生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂飲食配制方法 按照3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、10%豬油、5%蛋黃粉、76.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料比例配制。

1.2.2 動物模型制備及給藥方法 采用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3注射方法建立大鼠AS模型。健康雄性的Wistar大鼠40只，先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分配到假手術(shù)組、模型組、黃芩苷高、低劑量組，每組10只。假手術(shù)組大鼠在實驗開始第7天行假主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)，模型組、黃芩苷高、低劑量組大鼠在實驗開始7 d后給予主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)。然后假手術(shù)組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng);其余3組用高脂飼料喂養(yǎng)(15～25 g/d)，與此同時，在實驗開始時右下肢肌肉注射維生素D3針劑(30萬U/kg)，每隔30天重復(fù)1次。給藥方法:適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水5 ml灌胃，每天1次;黃芩苷高劑量組給予黃芩苷100 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次;黃芩苷低劑量組給予黃芩苷50 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次。

1.3 TAFI活性的測定 采用美國DIAGNOSTICA公司生產(chǎn)的TAFI ELISA試劑盒，經(jīng)美國產(chǎn)BIO-RAD Model550型全自動酶標(biāo)儀測定，采用發(fā)色底物法，步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 hs-CRP和IL-6活性測定 hs-CRP和IL-6活性測定試劑盒購于美國R＆D公司，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室提供的美國BIO-RAD Model550型全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，均采用酶聯(lián)免疫吸附法，步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 實驗4月后各組大鼠血漿TAFI、hs-CRP及IL-6的比較 與假手術(shù)組比較，模型組、黃芩苷高劑量組和黃芩苷低劑量組的TAFI、hs-CRP及IL-6水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，黃芩苷高低劑量組TAFI、hs-CRP及IL-6水平均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05);黃芩苷高低劑量組間比較，高劑量組hs-CRP和IL-6水平明顯低于低劑量組(P＜0.05)，TAFI水平則無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 TAFI水平與hs-CRP、IL-6的相關(guān)性分析 將全部研究對象作為一個整體，對TAFI活性水平與hs-CRP、IL-6進(jìn)行直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示，在大鼠AS發(fā)展過程中，TAFI活性水平與hs-CRP、IL-6均呈正相關(guān)(r分別為 0.278、0.547，P ＜0.01 或P＜0.05)。

表1 實驗4個月后不同組間TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比較(± s，n=10)

表1 實驗4個月后不同組間TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比較(± s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與黃芩苷高劑量組比較:4)P＜0.05

組別 hs-CRP(ng/L) IL-6(ng/L) TAFI(mg/L)假手術(shù)組85.66±10.73 38.95±1.99 29.5±0.05模型組 169.16±11.531) 76.24±4.321) 36.8±4.571)黃芩苷高劑量組 97.27±6.891)2) 42.41±1.591)2) 32.7±2.361)3)黃芩苷低劑量組 109.21±8.511)2)4)53.67±2.21)2)4) 31.3±1.571)3)

3 討論

郭延松〔3〕等綜合脂質(zhì)浸潤學(xué)說、鈣超載學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說、血栓形成學(xué)說等理論，成功地建立了大鼠AS模型。他們發(fā)現(xiàn)，大鼠可作為研究AS的良好動物模型，高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負(fù)荷可形成較成熟的AS斑塊。本課題組劉利妍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負(fù)荷的方法喂養(yǎng)大鼠4個月，可成功復(fù)制AS模型。也就是說用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負(fù)荷的方法復(fù)制AS模型是成熟可靠的。

Tregouet等〔5〕研究認(rèn)為，活化的TAFI是冠心病患者遠(yuǎn)期心血管病事件危險性的獨立預(yù)測因素。Schroeder等〔6〕對冠狀動脈疾病患者和對照組的研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的靜脈和冠狀動脈的TAFI水平比對照組升高，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，而且TAFI水平與總膽固醇、纖維蛋白水平和急性期反應(yīng)物水平具有相關(guān)性，提示在冠心病患者體內(nèi)TAFI參與炎癥的調(diào)節(jié)。劉利妍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，在AS發(fā)展過程中，隨著AS病變的加重，TAFI水平逐漸升高，并且與TG、TC水平呈正相關(guān)，說明TAFI參與AS的形成。本研究顯示TAFI在AS進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用。

C反應(yīng)蛋白(CRP)主要在 IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1等炎性遞質(zhì)調(diào)節(jié)下由肝細(xì)胞合成，不僅是反映炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，其本身還有炎癥因子的作用，直接參與AS的形成和發(fā)展〔7〕，可以促進(jìn)單核細(xì)胞向血管壁的黏附、下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶和前列環(huán)素的合成、激活內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的遷移增生和膠原降解。尤其是近年來hs-CRP檢測技術(shù)得到應(yīng)用，可準(zhǔn)確測定低濃度 CRP(0.15～10.00 mg/L)，hs-CRP作為炎癥標(biāo)志物被認(rèn)為是心血管事件危險性最強(qiáng)有力的預(yù)測因子。高水平的hs-CRP還可通過促進(jìn)纖溶酶原激活物抑制因子表達(dá)與纖維蛋白原一起參與血栓形成〔8〕，而且有臨床研究表明，C-反應(yīng)蛋白與血漿TAFI濃度成正相關(guān)〔9〕。本研究亦顯示，在AS大鼠模型中，TAFI活性水平升高，與hs-CRP、IL-6均呈正相關(guān)。

IL-6與CHD的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系，Choussat等〔10〕研究表明，IL-6作為炎癥細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)激活的巨噬細(xì)胞分化和浸潤，還可以上調(diào)黏附分子和其他細(xì)胞因子的表達(dá)，從而加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。Aydin等〔11〕研究認(rèn)為，冠心病患者的血清中炎性細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α的水平顯著升高。另有臨床研究證實〔12〕，IL-6在CHD患者循環(huán)水平顯著高于正常人群，而且血清IL-6水平的改變對日后發(fā)生的冠脈事件具有預(yù)測價值。

Ross發(fā)現(xiàn)〔1〕當(dāng)炎癥反應(yīng)引起內(nèi)皮損傷時，hs-CRP在IL-6調(diào)節(jié)下由肝細(xì)胞合成，前者通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)引起脂質(zhì)沉積，此時hs-CRP明顯升高。CRP在轉(zhuǎn)錄水平上由IL-6調(diào)節(jié)合成，CRP的升高是體內(nèi)“瀑布式”炎癥反應(yīng)中的一個環(huán)節(jié)，反過來可刺激IL-6的合成，形成CRP與IL-6之間的惡性循環(huán)。而且，IL-6還可以通過影響CPB2 mRNA的穩(wěn)定性使其濃度降低，進(jìn)而下調(diào)TAFI的表達(dá)〔13〕。本研究顯示，應(yīng)用黃芩苷干預(yù)動脈粥樣硬化大鼠后，血漿IL-6、hs-CRP水平明顯下降，其機(jī)制可能為IL-6水平降低，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上使hs-CRP表達(dá)下調(diào)，起到了在炎癥層面干預(yù)動脈粥樣硬化的作用。

黃芩苷的心血管保護(hù)作用主要有抗炎、清除氧自由基、抗缺血再灌注損傷等。在本研究中，在AS模型組應(yīng)用黃芩苷干預(yù)后hs-CRP、IL-6水平明顯降低，而以往的研究表明hs-CRP、IL-6水平與AS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)〔7，11〕，提示黃芩苷有抗AS炎癥過程的作用，可預(yù)防AS的發(fā)生和發(fā)展。黃芩苷干預(yù)后TAFI水平降低，可以恢復(fù)機(jī)體的凝血纖溶系統(tǒng)之間的精細(xì)平衡，進(jìn)而減少纖維蛋白沉積〔14〕。而且TAFI水平和hs-CRP、IL-6水平成正相關(guān)，黃芩苷可能通過降低AS過程中炎癥因子的表達(dá)進(jìn)而降低TAFI的表達(dá)，恢復(fù)凝血纖溶系統(tǒng)之間的精細(xì)平衡來干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展。

黃芩苷作為一種天然藥物，具有毒性低、副作用小等優(yōu)點，有待進(jìn)一步深入的基礎(chǔ)實驗研究和大規(guī)模的臨床試驗研究來進(jìn)一步證實其在起始階段防治AS中的作用機(jī)理及臨床應(yīng)用價值，為臨床AS及其相關(guān)疾病的防治開辟新的途徑。

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