張麗娜 張?zhí)炝?金國琴 (上海中醫(yī)藥大學生化教研室，上海 20203)

組織多普勒心臟超聲檢查表明老年人心肌收縮和舒張功能均有不同程度的降低〔1〕。衰老最有代表性的是自由基學說，認為衰老機體自由基含量增多〔2〕。而自由基對蛋白質(zhì)的影響是衰老的關鍵因素。肌球蛋白和肌動蛋白是重要的骨架蛋白，在心肌肌肉舒縮中有重要作用。人體從發(fā)育至衰老死亡，中醫(yī)認為是腎氣盛衰的過程，腎為先天之本。本研究選擇補腎益氣中藥——巴戟天作用衰老大鼠心肌細胞模型，研究其對衰老心肌細胞肌球蛋白和肌動蛋白基因表達是否具有改善作用;檢測衰老心肌細胞模型中的肌球蛋白和肌動蛋白的表達變化，探討衰老心肌收縮功能衰退的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 24 h內(nèi)的SD新生大鼠，雌雄不拘。由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要實驗試劑 胰蛋白酶(Amresco)，Ⅰ型膠原酶(Invitrogen)，Ⅱ型膠原酶(Invitrogen)，DMEM-F12(Gibco)，胎牛血清(FBA，Gibco)，5-溴脫氧尿嘧啶(Sigma)，二甲基亞砜(DMSO，ICN)，噻唑藍(MTT，Sigma)，β-半乳糖苷酶活性測定試劑盒(Cell Signaling)，Ttizol(Invitrogen)，PCR 反轉錄試劑盒、dNTP、Taq聚合酶(Fermentas)，小鼠抗兔α-actin單克隆抗體(Santa cruz)。

1.1.3 主要實驗設備 滅菌鍋(造鑫企業(yè)有限公司)，超凈工作臺(造鑫公司)，恒溫CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)，冷凍離心機(Eppendorf)，恒溫震蕩水浴箱(上海精宏設備公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus)，PCR擴增儀(Bio-Rad)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio-TEC)，凝膠掃描及分析系統(tǒng)(上海復日科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞的原代培養(yǎng)及純化方法〔3，4〕出生24 h以內(nèi)的SD大鼠數(shù)只，乙醇消毒后處死，手術剪取心，置生理鹽水中。用小彎鑷取心尖部，至D-hanks液中，清洗，剪碎。加入胰酶混合液5 ml(0.125%胰酶+0.03%膠原酶Ⅱ+0.1%膠原酶I)，80 r/min 37℃震蕩水浴箱7 min，棄上清。重復該步驟。向沉淀中加入胰酶混合液5 ml，吹打數(shù)次，消化10 min(80 r/min 37℃震蕩水浴箱10 min)，取出后反復輕柔吹打1 min，自然沉淀得到上清與沉淀。上清經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾至一置于冰上的內(nèi)放20 ml含10%FBA的DF12小燒杯中，以終止消化。沉淀加入胰酶混合液，同上消化5 min，反復吹打1 min，將上清移入前燒杯中。重復該步驟，直到沉淀消失為止。總消化時間控制在0.5 h以內(nèi)。由以上步驟得到的上清總量均分為兩管，4℃，2 000 r/min，離心5 min。上清棄除。兩管的沉淀即為心肌細胞，清洗細胞，細胞加入10 ml含10%FBA的DF12混懸，并加入雙抗制得細胞懸液。接種于培養(yǎng)皿，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中，90 min，進行差速貼壁以清除非心肌細胞。將培養(yǎng)液懸液(主要是心肌細胞)細胞計數(shù)。用含10%FBA的DF12調(diào)整細胞密度至5×105～1×106個/ml，并加入終濃度為 10－4mol/L溴脫氧核苷尿嘧啶(BRDU)，以抑制非心肌細胞培養(yǎng)。接種于培養(yǎng)板上。接種96孔板時細胞密度調(diào)整為1×105，接種24孔板、6孔板時細胞密度調(diào)整為1×106，48 h后換液。以后每2天換一次液，每日進行心肌細胞鑒定:倒置光學顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)及心肌細胞跳動的頻率。

1.2.2 實驗分組 原代培養(yǎng)SD大鼠心室肌細胞，48 h后用8 mg/ml的D-半乳糖處理心肌細胞〔3〕制備模型，分為:對照組、模型組(終濃度8 mg/ml D-半乳糖)、模型+巴戟天組(終濃度8 mg/ml D-半乳糖+終濃度為0.5 mg/ml巴戟天)。誘導培養(yǎng)48 h后，停用半乳糖，模型組改用正常培養(yǎng)基換液，模型+巴戟天組改用含0.5 mg/ml巴戟天的正常培養(yǎng)基換液。各組繼續(xù)培養(yǎng)5 d，模型組可得到衰老模型。進行各指標的檢測。

1.2.3 藥物制備 巴戟天提取物的制備〔5〕:稱取巴戟天200 g，2 L雙蒸水浸泡2 h。武火煮沸后，文火煮30 min，取藥液。藥渣再加入8倍量雙蒸水浸泡2 h，武火煮沸后，文火煮30 min，取藥液。將兩次藥液合并，紗布過濾，制得中藥水煎液。90℃水浴濃縮至200 ml，即得到1 g/ml的藥液。按體積比(中藥∶乙醇=2∶3)加入無水乙醇，充分混勻，4℃冰箱靜置過夜。次日，1 500 r/min，離心15 min，取上清(約 300 ml)。90℃水浴揮發(fā)乙醇，定容至 200 ml。即藥液的終濃度為 1 g/ml。0.22 μm過濾器過濾除菌。－20℃保存待用。

1.2.4 衰老模型的評價 β-半乳糖苷酶活性是鑒定細胞衰老的一個生物學標志。隨著細胞老化，在pH6.0的條件下，細胞內(nèi)增高的β-半乳糖苷酶降解其底物X-半乳糖后，產(chǎn)生的藍色產(chǎn)物也增多。藥物處理后，即第10天，96孔板細胞進行β-半乳糖苷酶活性檢測;MTT法測定細胞存活率。

1.2.5 測定指標和方法 α-MHC mRNA和β-MHC mRNA的表達檢測:藥物處理后，即第10天，抽提mRNA，RT-PCR方法檢測α-MHC mRNA和β-MHC mRNA表達。α-actin蛋白表達的檢測:第10天裂解細胞，抽提蛋白質(zhì)并測定蛋白含量，蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，一抗(1∶200稀釋)4℃冰箱孵育過夜，洗膜，二抗37℃條件孵育45 min，洗膜，電偽學發(fā)光(ECL)顯影、曝光。RT-PCR及Western印跡圖片均采用FR-200紫外與可見分析裝置進行圖像掃描及分析，RT-PCR結果以目的擴增產(chǎn)物與內(nèi)參β-actin擴增產(chǎn)物的比值作為表達量，Western印跡結果以條帶平均光密度(OD值)/3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(36 KD)作為表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗。

2 結果

2.1 原代細胞鏡下變化 原代細胞培養(yǎng)第10天在倒置相差顯微鏡下觀察，正常組細胞大多成簇連接，同簇搏動明顯。而模型組大部分細胞僅以偽足相互連接成網(wǎng)，同簇搏動弱。巴戟天組細胞也大部分成簇連接，同簇搏動較模型組有所提高。見圖1。

2.2 心肌細胞β-半乳糖苷酶活力及細胞活力 與正常組相比，模型組細胞內(nèi)衰老特征性指標β-半乳糖苷酶活力顯著性升高，且細胞活力明顯下降(P＜0.05)，說明模型建立成功。而巴戟天組細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活力相比于模型組顯著下降(P＜0.05)，表明巴戟天較明顯地抑制了衰老特征性指標β-半乳糖苷酶活力的上升;且細胞活力顯著性升高(P＜0.05)，表明巴戟天提高了衰老細胞的活力。見表1。

2.3 電泳條帶圖像分析 與正常組細胞相比較，模型組α-MHC mRNA表達明顯下降(P＜0.05);巴戟天組的α-MHC mRNA表達較模型組升高(P＜0.05)。表明巴戟天可一定程度上抑制衰老細胞α-MHCmRNA表達的降低。正常組β-MHCmRNA表達非常低;模型組β-MHC mRNA出現(xiàn)較高表達(P＜0.05);巴戟天組的β-MHC mRNA表達較模型組低(P＜0.05)，但遠高于對照組，提示巴戟天雖然可抑制衰老細胞 β-MHC mRNA表達升高，但是不能完全修補D-半乳糖帶給細胞的影響。見圖2，表1。

表1 大鼠心肌細胞β-半乳糖苷酶、細胞活力、α、β-MHC mRNA(±s)

表1 大鼠心肌細胞β-半乳糖苷酶、細胞活力、α、β-MHC mRNA(±s)

與正常組相比:1)P＜0.05;與模型組相比:2)P＜0.05

組別β-半乳糖苷酶活力MTT α-MHC/β-actin比值β-MHC/β-actin正常組0.282±0.189 0.648±0.089 2.7±0.33 0.20±0.12模型組 0.694±0.1131)0.426±0.0881) 1.9±0.381) 1.21±0.341)巴戟天 0.428±0.0352)0.579±0.0502) 2.4±0.272) 0.82±0.532)

圖1 原代細胞的鏡下變化(×200)

2.4 細胞α-actin蛋白的表達 與正常組相比(0.364 7±0.028)，模型組、巴戟天組大鼠心肌細胞α-actin蛋白相對表達均無顯著性變化〔(0.357 9±0.032)、(0.375 2±0.047)，P＜0.05〕。見圖 3。

圖2 大鼠心肌細胞α-MHC、β-MHC mRNA表達的電泳圖

圖3 大鼠心肌細胞α-actin的蛋白表達(Western印跡)

3 討論

肌球蛋白是重要的骨架蛋白，是一個大分子六聚體，由兩條重鏈(α-MHC和β-MHC)及四條輕鏈組成〔6〕。重鏈基因所編碼的重型肌球蛋白具有ATP酶的活性，催化ATP分解釋放能量，使心肌肌絲滑動收縮做功。研究表明α-MHC和β-MHC的比例是決定心臟收縮速度和收縮力的關鍵因素，以α-MHC為主的心臟比以β-MHC為主的心臟具有更強大的收縮力〔7〕。本實驗結果顯示衰老心肌細胞α-MHC mRNA水平較正常組下降，β-MHC mRNA表達上升，與以往的研究一致。這說明衰老可能通過降低α-MHC和β-MHC的比值降低了心肌的舒縮力。巴戟天組細胞α-MHC mRNA表達顯著性上調(diào)，β-MHC mRNA表達顯著性下調(diào)，提示出補腎益氣藥巴戟天可能通過調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈基因的表達提高衰老心肌的收縮力。

肌動蛋白可能是活性氧損傷的主要靶蛋白分子之一。在哺乳動物的心臟，可表達兩種形式的α-actin:α-cardiac actin和α-skeletal actin。有報道兩種α-actin在心肌衰竭發(fā)展不同階段表達不同，但是也有報道指出，心肌組中總α-actin的水平是受嚴格控制的〔8〕。本研究大鼠心肌總α-actin的表達各組均恒定，是否衰老也許對肌動蛋白并沒有損傷作用，或者是心肌中α-actin的兩種形式當一種表達降低時，另外一種會協(xié)調(diào)性的增加，但總水平恒定，有待進一步探討。

1 沈景霞，修春紅，樊 英，等.心肌組織多普勒速度顯像定量評價健康老年人心室功能〔J〕.中華老年醫(yī)學雜志，2005;24(2):85-8.

2 趙保路.自由基、營養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老〔J〕.生物物理學報，2010;26(1):26-36.

3 王 琳，丁秀云，劉謨焓，等.D-半乳糖對幼鼠心肌細胞擬衰老作用的實驗〔J〕.中國臨床康復，2005;9(39):25-7.

4 許 浩，葛亞坤，鄧同樂，等.人參皂苷Rb1對H2O2誘導新生大鼠心肌細胞凋亡的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2005;21(7):803-6.

5 張賀鳴，韓聯(lián)合，馮國清，等.巴戟天對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的防護作用〔J〕.河南中醫(yī)學院學報，2005;20(3):20-1.

6 魏 嵐，王 玲.心肌收縮蛋白的結構與功能研究進展〔J〕.生物醫(yī)學工程學雜志，1997;14(3):299-308.

7 童普德，王曉玲，胡旭東，等.延衰中藥補腎益精方對大鼠左心室α、β-MHC mRNA增齡變化的影響〔J〕.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2001;7(4):34-6.

8 Buttrick P，Malhotra A，F(xiàn)actor S，et al.Effect of aging and hypertension on myosin biochemistry and gene expression in the rat heart〔J〕.Circ Res，1991;68(3):645-52.