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        三氧化二砷聯合維生素C對耐藥性肺腺癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Survivin活性的影響

        2011-08-02 09:30:20曾錦榮蔣碧佳王績英桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科廣西桂林541001
        中國老年學雜志 2011年24期
        關鍵詞:誘導劑量蛋白

        曾錦榮 蔣碧佳 王績英 (桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科,廣西 桂林 541001)

        近年來國內外應用三氧化二砷(AS2O3)治療白血病已取得令人矚目的進展,并嘗試AS2O3用于抑制實體瘤的增殖。目前,有研究已證實AS2O3對肺癌有抑制作用且呈劑量依賴關系但劑量過高雖然可誘導癌細胞凋亡,但同時可致細胞毒殺傷作用可能對正常細胞產生細胞毒性作用致細胞壞死。有研究顯示維生素(Vit)C對化療藥物所致細胞損傷具有保護作用,且對AS2O3抗癌作用具有協(xié)同性。此研究應用As2O3聯合Vit C對人耐藥肺腺癌裸鼠移植瘤模型進行干預觀察抑瘤效果,探討其抑瘤機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物和瘤株 實驗動物:BALB/c-nu裸鼠40只,鼠齡6~8周齡,體質量16~24 g,由桂林醫(yī)學院實驗動物中心提供(合格證號:SCXK桂2007-0001)。瘤株:肺腺癌耐藥株A549/R(實驗室自備)。

        1.1.2 藥物及試劑 DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液(GIBCOL公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司);AS2O3注射液(哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司);Vit C注射液(天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司);Trizol(TaKaRa公司)、PCR反應體系(TaKaRa公司)、DNA marker(TaKaRa公司);Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA引物(上海生工生物工程技術服務有限公司);Survivin、Caspase-3一抗(Santa Cruz公司),辣根酶標記抗小鼠IgG二抗,辣根酶標記抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術公司);Western印跡及IP細胞裂解液,BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型),預染蛋白質分子量標準,超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);PVDF膜/0.22 μm(Millipore公司);柯達X-OMAT BT醫(yī)用X射線膠片(Kodak公司)。

        1.1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(德國Thermo scientific公司),超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),倒置相差顯微鏡(德國ZEISS公司),LegendMiro21微量臺式高速離心機(德國Thermo scientific公司),5804R多功能高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司),MLDEL680酶標儀(美國 Bio-RAD公司),Personal48 PCR儀(德國Biometra公司),紫外分光光度計(德國Eppendorf公司),JS-780全自動數碼凝膠成像分析系統(tǒng)(培清科技),DYY-6D電泳儀電源(北京六一儀器廠),DYCP-31A瓊脂糖電泳槽(北京六一儀器廠),MINI-4垂直電泳儀(美國Bio-RAD公司),Image-Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng)及裸鼠移植瘤模型建立 A549/R細胞置于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。每2~3天換液1次,4 d傳代。取指數生長期A549/R細胞加入0.25%胰蛋白酶消化1 min,消化期間不斷搖晃培養(yǎng)瓶,至細胞變圓。加入4 ml含血清培養(yǎng)基終止消化,并輕輕反復吹打貼壁細胞,使細胞從瓶壁上脫落,將細胞轉至無菌離心管中,細胞懸液計數、臺盼藍染色。確定細胞活力在95%以上,細胞不成團,再以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入PBS洗3次,最后調整細胞濃度為1×108個/ml細胞懸液備用。

        取上述細胞懸液以0.2 ml/鼠接種于裸鼠右前肢腋窩皮下,接種后每天觀察有無腫瘤形成及注射點有無破潰紅腫,按規(guī)定時間測量腫瘤體積大小,腫瘤長至體積約為100~130 mm3左右且無自發(fā)性出血、壞死及感染病灶時為模型建立成功。

        1.2.2 分組及處理 選擇荷瘤成功的裸鼠30只,隨機分5組,每組6只。對照組:只給予生理鹽水,0.2 ml/次皮下注射,每48 h注射1次,共8次;Vit C組:按250 mg/kg給藥;1.5、3.0 mg/kg AS2O3組分別給 AS2O31.5、3.0 mg/kg;AS2O3聯合Vit C組:予給1.5 mg/kg AS2O3和250 mg/kg Vit C。

        1.2.3 觀察指標及方法

        1.2.3.1 移植瘤體積及抑制率 每周測量腫瘤長、寬最大垂直直徑,按公式計算腫瘤體積。用藥結束后2 d處死裸鼠,取出腫瘤,稱質量。按公式計算腫瘤抑制率。腫瘤體積(mm3)=(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)/2。抑瘤率=(對照組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%。

        1.2.3.2 免疫組化檢查 將移植瘤標本4%多聚甲醛固定,石蠟切片,免疫組織化學染色檢測腫瘤組織Caspase-3、Survivin蛋白表達情況。細胞胞質染色為棕色至棕褐色為陽性細胞標志。每組隨機選3個標本,每個標本在高倍鏡下隨機選取5個視野,應用Image-Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件,分析陽性細胞光密度值(OD值),判斷藥物對腫瘤Caspase-3、Survivin蛋白的影響。

        1.2.3.3 RT-PCR檢測腫瘤Caspase-3、Survivin mRNA的表達水平 液氮研磨組織提取總RNA,取100 mg組織加入1 ml Trizol,提取總 RNA。紫外分光光度計測定 OD260及 OD280值,分析RNA純度并調整濃度。逆轉錄反應(cDNA的制備)反應體系按試劑盒說明進行。Caspase-3 mRNA上游引物:5'-TTG GAA CAA ATG GAC CTG TTG ACC TG-3',下游引物:5'-GGA CTC AAA TTC TGT TGC CAC CTT TC-3',擴增產物365 bp;Survivin mRNA上游引物:5'-CCC TTT CTC AAG GAC CAC CGC ATC-3',下游引物:5'-GCC AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3',擴增產物133 bp;β-actin上游引物:5'-AGT GTG ACG TGG ACA TCC GCA-3',下游引物:5'-ATC CAC ATC TGC TGG AAG GTG GAC-3',擴增產物243 bp。PCR條件:94℃預變性5 min,94℃ 30 s,61℃ 30 s,72℃ 45 s,共 30 個循環(huán),72℃延伸 7min。擴增產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,EB顯色應用凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進行掃描分析,計算相對表達水平。

        1.2.3.4 Western印跡檢測腫瘤Caspase-3、Survivin蛋白表達水平 液氮研磨組織提取蛋白,取100 mg組織加入0.75 ml細胞裂解液提取總蛋白。運用BCA法測定蛋白量。每例取50 μg,與4×上樣緩沖液混合后煮沸5 min,在15%SDS-PAGE電泳,然后電轉移至0.22 μm PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后,加入Caspase-3、Survivin兔多抗IgG一抗(稀釋濃度1∶200)4℃孵育過夜,辣根酶標記抗兔IgG二抗(稀釋濃度1∶8 000)37℃孵育1 h;β-actin鼠單克隆抗體一抗(稀釋濃度1∶1 000)4℃孵育過夜,辣根酶標記抗鼠IgG二抗(稀釋濃度1∶8 000)37℃孵育1 h,ECL熒光顯色后暗室X片曝光。

        1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,實驗重復3次,采用單因素方差分析和χ2檢驗。

        2 結果

        2.1 一般性觀察 裸鼠體內成瘤情況40只裸鼠,有38只荷瘤成功,成瘤率95%,成瘤時間為細胞種植后第7~16天。腫瘤細胞種植后第21天左右,腫瘤直徑平均達5 mm。實驗前各組裸鼠一般狀態(tài)良好;實驗結束時30只裸鼠全部存活。動態(tài)觀察發(fā)現,生理鹽水組裸鼠活動減少,反應遲鈍;4個治療組裸鼠覓食、飲水、活動等狀況良好,未發(fā)現腹瀉、淤血等現象。

        2.2 體重變化 各組治療前裸鼠體質量均無顯著性差異,治療后1.5,3 mg/kg AS2O3組及AS2O3+Vit C組裸鼠體質量無統(tǒng)計學差異,對照組與Vit C組較其他組體質量減少(P<0.05)。見表1。

        2.3 腫瘤體積及質量變化 各組裸鼠治療前腫瘤體積無統(tǒng)計學差異具有可比性;治療 7 d后 1.5,3 mg/kg AS2O3組及AS2O3+Vit C組裸鼠腫瘤體積與對照組相比明顯減小(P<0.05);治療14 d后1.5,3 mg/kg AS2O3組及 AS2O3+Vit C組裸鼠腫瘤體積較對照組腫瘤明顯減小(P<0.01);以聯合用藥組最為明顯,抑瘤率為79.93%,其次為AS2O33.0 mg/kg組(66.25%)。見表2,表3。

        表1 各組治療前后裸鼠體質量變化(s,n=6,g)

        表1 各組治療前后裸鼠體質量變化(s,n=6,g)

        與對照組、Vit C組比較:1)P<0.05

        組別 治療前 治療后對照組18.49±1.52 17.84±0.78 Vit C組 18.59±2.16 17.76±1.97 1.5 mg/kg AS2O3組 17.76±1.27 18.73±1.391)3.0 mg/kg AS2O3組 18.67±1.57 20.51±1.821)AS2O3+Vit C組 19.30±2.48 21.19±2.671)

        2.4 免疫組織化學染色檢測腫瘤組織Caspase-3、Survivin蛋白表達情況 單用Vit C組Caspase-3、Survivin表達無顯著改變,用As2O3組隨著濃度的增加,Caspase-3表達增加,陽性率增高、Survivin表達減少陽性率降低。聯合用藥組對Caspase-3、Survivin表達的影響亦明顯,與單用Vit C及1.5 mg/kg As2O3組相比有顯著性差異(P<0.05)。見圖1、圖2,表4。

        表2 各組治療前后裸鼠腫瘤體積變化( s,n=6,mm3)

        表2 各組治療前后裸鼠腫瘤體積變化( s,n=6,mm3)

        與對照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

        組別 治療前 治療7 d 治療14 d對照組108.97±5.51 2 536.86±135.14 3 443.89±168.37 Vit C組 114.32±9.58 2 480.66±158.67 3 323.78±191.37 1.5 mg/kg AS2O3組 112.42±5.55 2 131.65±166.051)1 986.34±192.27 3.0 mg/kg AS2O3組 115.05±8.09 1 395.66±271.411)1 162.36±217.052)AS2O3+Vit C組 116.96±16.84 884.99±254.091)691.13±217.312)

        表3 各組治療后裸鼠腫瘤體質量及抑瘤率(± s,n=6)

        表3 各組治療后裸鼠腫瘤體質量及抑瘤率(± s,n=6)

        與對照組比較:1)P<0.01

        組別 腫瘤質量(g) 抑瘤率(%)對照組2.92±0.14 -Vit C組 2.82±0.16 3.42 1.5 mg/kg AS2O3組 1.69±0.16 42.3 3.0 mg/kg AS2O3組 0.99±0.181) 66.25 AS2O3+Vit C組 0.59±0.181)79.93

        圖1 Caspase-3蛋白的免疫組織化學結果(DAB,×400)

        圖2 Survivin蛋白的免疫組織化學結果(DAB,×400)

        表4 Caspase-3、Survivin蛋白陽性細胞平均光密度值比較( s,n=15)

        表4 Caspase-3、Survivin蛋白陽性細胞平均光密度值比較( s,n=15)

        與對照組比較:1)P<0.05;下表同

        組別Caspase-3 Survivin對照組0.205±0.083 0.628±0.137 Vit C組 0.226±0.0311) 0.562±0.1281)1.5 mg/kg As2O3組 0.419±0.0851) 0.253±0.0721)3.0 mg/kg As2O3組 0.663±0.131) 0.211±0.0831)As2O3+Vit C組 0.664±0.0651) 0.169±0.0481)

        2.5 PCR檢測結果 As2O3能下調Survivin mRNA的表達,上調Caspase-3 mRNA的表達,與劑量呈正相關,單用Vit C對Survivin、Caspase-3 mRNA沒有明顯的作用,但Vit C聯合低劑量As2O3則能明顯抑制Survivin mRNA的表達及有效上調Caspase-3 mRNA的表達,效果略優(yōu)于單用高劑量As2O3組。見圖 3,表 5。

        2.6 Western印跡檢測結果 見圖4。As2O3能使無活性Pro-Caspase-3轉化為有活性的Caspase-3發(fā)揮凋亡作用,且呈劑量依賴性。Vit C聯合低劑量As2O3則能明顯上調Caspase-3蛋白表達,效果優(yōu)于單用高劑量As2O3組。As2O3亦能有效下調Survivin蛋白的表達,呈劑量依賴性,單用Vit C對Caspase-3、Survivin作用,但Vit C聯合低劑量As2O3則能明顯抑制 Survivin,效果優(yōu)于單用高劑量As2O3組。

        圖3 各組Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA表達水平

        圖4 各組Caspase-3、Survivin蛋白表達

        表5 各組Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表達水平比較(± s,n=6)

        表5 各組Caspase-3 mRNA、Survivin mRNA表達水平比較(± s,n=6)

        組別Caspase-3 mRNA Survivin mRNA對照組0.061±0.029 0.553±0.072 Vit C組 0.167±0.037 0.504±0.069 1.5 mg/kg As2O3組 0.386±0.04 0.468±0.049 3.0 mg/kg As2O3組 0.632±0.0421) 0.257±0.0671)As2O3+Vit C組 0.806±0.0281) 0.160±0.0591)

        3 討論

        誘導細胞凋亡殺傷腫瘤細胞,不會引起機體強烈的炎癥反應,同時能保護機體的正常組織不受影響,因此開發(fā)研究誘導腫瘤細胞凋亡的藥物成為目前研究的熱點與趨勢。細胞凋亡通路主要有線粒體通路、死亡受體通路、內質網通路,Caspase-3死亡受體途徑和線粒體途徑的共同通道,Caspase-3的表達增加可以標志著細胞內的凋亡機制已經啟動〔1〕。而IAPs家族的新成員Survivin是目前發(fā)現的最強的凋亡抑制因子之一,也是細胞周期調節(jié)基因,它能直接或間接地抑制凋亡終末效應蛋白Caspase-3與Caspase-7的活化而阻止細胞凋亡;通過與紡錘體纖維結合,間接抑制Caspase對紡錘體的水解,有利于保護有絲分裂的完整性抑制細胞的凋亡。

        AS2O3是中藥砒霜的主要成分,已用于臨床急性早幼粒白細胞病的治療,對多種實體瘤也已從體外細胞、動物移植瘤到臨床試驗都觀察到明顯的療效〔2~5〕。但AS2O3抗腫瘤機制復雜而廣泛,目前其抗腫瘤機制尚未完全明確,與一般的化療藥物相比,AS2O3能只殺傷腫瘤細胞而不損傷正常細胞〔6〕,主要與誘導腫瘤細胞凋亡有關〔7〕,其機制可能是通過開放線粒體通透性轉運孔道、破壞線粒體跨膜電位、改變胞質鈣離子濃度及氧化還原電位、活化Caspase家族、下調Survivin、Bcl-2活性等。已有研究證實AS2O3可誘導肺癌耐藥細胞凋亡〔8〕,但高劑量AS2O3能對正常細胞產生細胞毒作用,從而限制了AS2O3治療肺癌方面的應用。目前以AS2O3為基礎的聯合化療成為研究的熱點。本研究顯示AS2O3能抑制Survivin的表達,上調Caspas-3的表達,與劑量呈正相關,抑制腫瘤生長,促進腫瘤凋亡。

        VitC是具有多種生物學功能的水溶性己糖衍生物,它既是細胞保護劑,同時也可能是AS2O3抗腫瘤的協(xié)同劑,其機制可能是通過氧化作用進一步減少腫瘤細胞內本來就缺乏的過氧化物酶,并增加過氧化氫的產生〔9〕,從而作用于pro-Caspase-3激活Caspase-3誘導細胞凋亡,抑制腫瘤的生長。有體外實驗證明Vit C能抑制肺癌A549細胞的增殖,及誘導其凋亡〔10〕,但在本實驗中單用臨床用藥量Vit C對移植瘤無明顯的抑制作用,這可能與藥物的血藥濃度,半衰期,及到達腫瘤組織的藥物量有關。此外Vit C在抗腫瘤應用上存在爭議,一方面Vit C能清除氧自由基,修復DNA損傷,增強機體免疫功能及誘導細胞凋亡,但高劑量Vit C可將脂質過氧化物降解為內源性的基因毒性物質,也可導致過氧化亞硝酸鹽誘導DNA毒性及單股DNA鏈的斷裂,可能對細胞產生毒性作用及導致細胞的癌變〔11〕。因此Vit C被建議作為腫瘤輔助治療藥物。本研究顯示單用Vit C對Survivin及Caspase-3作用不明顯,對移植瘤沒有明顯的抑制作用。而Vit C聯合低劑量AS2O3抑制Survivin表達及上調Caspas-3的作用較高劑量AS2O3更強,抑制腫瘤的生長的效果更好。提示Vit C可能阻止Survivin與Caspase-3的結合,影響腫瘤細胞的凋亡過程,它與AS2O3聯用能更有效地促進耐藥性肺癌細胞的凋亡。本研究為以AS2O3為基礎的肺癌治療方案在臨床上的運用提供了一定的理論依據。

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        3 張興榮,蔡洪培,鄧志華,等.三氧化二砷對胃癌裸鼠腹腔轉移瘤的形成及其機制的初步研究〔J〕.癌癥,2002;20(4):477-9.

        4 Dai J,Weinberg RS,Waxman S,et al.Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic trioxide through modulation of the glutathione redox system〔J〕.Blood,1999;93:268-77.

        5 黃守國,孔北華,楊瑞芳,等.三氧化二砷抑制人卵巢癌裸鼠腹腔轉移瘤的形成及其機制的初步研究〔J〕.癌癥,2002;21:401-4.

        6 鄧 志,蔡洪培,李 石,等.三氧化二砷對正常肝細胞及肝癌細胞株的影響〔J〕.中華消化雜志,1999;19(4):277.

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        10 曾錦榮,譚 寧,翟彭勇,等.維生素C對AS2O3抑制肺癌A549細胞增殖、誘導細胞凋亡作用的影響及機制〔J〕.山東醫(yī)藥,2010;50(3):7-9.

        11 LEE SH,OE T,BLAIR IA.Vitamin C induced de-composition of lipid hydroperoxides to endogenous geno-toxins〔J〕.Science,2001;292(5524):2083-6.

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