鄔云斌 劉新偉 何東偉 劉 玲 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶 400016)

白藜蘆醇是一種在紅酒和葡萄中存在的多酚類化學(xué)物質(zhì)，具有強(qiáng)大的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎癥等生物學(xué)特性，并且是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好的沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1(silent information regulator protein 1，sirt1)激活劑。sirt1是一種NAD+依賴的蛋白去乙?；?，該酶的類似物首先在酵母中發(fā)現(xiàn)，對(duì)延緩細(xì)胞衰老具有重要作用。研究證實(shí)sirt1在心肌缺血再灌注(I/R)損傷中起著重要的保護(hù)作用〔1～3〕。陳麗函等〔1〕和 Yoshida等〔4〕先后報(bào)道了白藜蘆醇能顯著減輕大鼠心肌I/R損傷，其作用一定程度上和sirt1相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。近年來有研究報(bào)道sirt1抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促凋亡蛋白p53去乙?；嘘P(guān)〔5〕。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)實(shí)驗(yàn)證實(shí)白藜蘆醇是否通過sirt1-p53通路起到對(duì)I/R損傷心肌的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用在體大鼠心肌I/R動(dòng)物模型，通過研究白藜蘆醇在大鼠心肌I/R損傷中的作用，探討其保護(hù)作用與sirt1-p53通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立 健康雄性成年Wistar大鼠48只，體質(zhì)量240～270 g(清潔級(jí)，合格證號(hào):重醫(yī)動(dòng)質(zhì)20101105)購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為4組:單純I/R組、白藜蘆醇預(yù)處理組(Res+I/R組)，白藜蘆醇預(yù)處理+ex527組(Res+ex527+I/R 組)，I/R+ex527組(I/R+ex527組)，每組12只。實(shí)驗(yàn)前置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境1 w。20%烏拉坦1 g/kg靜脈麻醉大鼠，打開胸腔，暴露心臟剪開心包膜，于大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支根部穿線結(jié)扎，觀察心電圖出現(xiàn)ST段立即抬高，心肌顏色由紅色變?yōu)榛野咨珵槌晒?biāo)志，然后以鹽水紗布覆蓋，結(jié)扎45 min后剪開結(jié)扎線，恢復(fù)血流造成再灌注，再灌注時(shí)抬高的ST段回落50%以上，心肌顏色由灰白色變?yōu)榧t色，再灌注24 h后將大鼠處死。假手術(shù)組:僅開胸，于大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支根部穿線但不結(jié)扎;I/R組:以生理鹽水代替白藜蘆醇舌下靜脈給藥，余與預(yù)處理組相同;Res+I/R組:白藜蘆醇10 mg/kg分別于缺血前15 min及再灌注前1 min舌下靜脈給藥;Res+ex527+I/R組:白藜蘆醇加藥情況同前，分別于缺血前15 min及再灌注前1 min舌下靜脈給藥 ex527 1 μg/kg;ex527+I/R組:ex527加藥情況同前。

1.2 試劑 白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Alexis公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自Maxim BIO公司;兔抗大鼠第382位賴氨酸殘基乙?；痯53(A-p53)購(gòu)自博奧森公司;兔抗大鼠SIRT1購(gòu)自protein tech公司;抗鼠/兔二抗及兔多抗GAPDH購(gòu)自于碧云天公司。sirt1特異性抑制劑ex527購(gòu)自caygen公司。

1.3 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 操作按TUNEL檢測(cè)試劑盒說明。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即取各組大鼠心尖部位的心肌常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片。從每組取5張石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，然后PBS沖洗(共3次，每次5 min，下同);接著蛋白酶 K(20 μg/ml)消化30 min(37℃)，PBS沖洗;而后3%H2O2室溫下處理5 min，加入含0.1%TritonX-100枸櫞酸溶液，冰上4 min，PBS沖洗;再加入50 μl TUNEL 反應(yīng)混合液(包括脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶液)，于37℃孵育60 min，PBS沖洗，然后加入POD液于37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，光鏡下觀察。采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡率即凋亡指數(shù)(AI)=凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)/心肌細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定 動(dòng)物處死后，采用分光光度法測(cè)定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，按照試劑盒說明操作。

1.5 心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的免疫組化測(cè)定 每一標(biāo)本取2個(gè)不同部位的切片各2張，采用鏈霉菌素抗生物素復(fù)合體(streptavidin-biotin complex，SABC)免疫組化檢測(cè) Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。主要流程如下:切片脫蠟入水→1%過氧化氫封閉POD 10 min→加山羊血清封閉→加Bcl-2、Bax蛋白的抗體，4℃過夜→滴加小鼠抗地高辛，再滴加生物素化抗小鼠IgG，37℃，30 min→加SABC，用DAB顯色→蘇木素復(fù)染→水洗，封片→鏡檢。陰性對(duì)照不加抗體，陽(yáng)性對(duì)照用已知陽(yáng)性片，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞質(zhì)著棕黃色為陽(yáng)性，用計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)，每次隨機(jī)選10個(gè)視野，測(cè)定細(xì)胞陽(yáng)性染色的OD值與陽(yáng)性細(xì)胞百分比，計(jì)算蛋白陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)(positive expression index，PEI)，PEI=OD值×陽(yáng)性細(xì)胞百分比×100，計(jì)算Bax和Bcl-2的比值。

1.6 Western印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 取各組大鼠心尖部位心肌組織，勻漿器研碎，加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各標(biāo)本取50 μg，上樣，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉后分別加入一抗和二抗，一抗為兔抗大鼠第382位賴氨酸殘基乙?；痯53(1∶100)及兔抗大鼠sirt1(1∶1 000)，加入 ECL試劑，暗室曝光，顯影、定影。電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析，結(jié)果以GAPDH校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組I/R心肌TUNEL染色結(jié)果 結(jié)果顯示，用TUNEL法染色的陽(yáng)性的心肌細(xì)胞具有形態(tài)變圓或不規(guī)則、與周圍組織脫離、核固縮、染色質(zhì)濃聚等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征，主要位于心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處，而在心肌梗死區(qū)和非梗死區(qū)內(nèi)僅見極少數(shù)散在凋亡細(xì)胞。與I/R組(18.31% ±2.76%)相比，Res+I/R組AI(9.08% ±2.56%)顯著降低(P＜0.05)，Res+ex527+I/R組(17.08% ±2.67%)、ex527+I/R組(18.23% ±2.46%)無(wú)顯著差別(P＞0.05);與 Res+I/R組相比，Res+ex527+I/R組、ex527+I/R組AI顯著升高(P＜0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌TUNEL染色結(jié)果(×200)

2.2 各組心肌組織中SOD、CK、LDH等生化指標(biāo)變化 與I/R組相比，Res+I/R組CK、LDH顯著減少，SOD顯著增加。而加入sirt1特異性阻斷劑ex527后，Res+ex527+I/R組較Res組CK、LDH顯著增高，SOD顯著降低(P＜0.05)。Res+ex527+I/R組與I/R組及ex527+I/R組相比，其差異不顯著(P＞0.05)。見表1。

2.3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化 Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的部位與凋亡細(xì)胞十分相似。與I/R組相比，Res+I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)，Bax/Bcl-2低于I/R組(P＜0.05)，加入阻斷劑ex527后，與Res+I/R組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，Bax/Bcl-2高于Res組。與Res+ex527+I/R組相比，I/R組及ex527+I/R組Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，Bax/Bcl-2無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見表 2，圖 2。

表1 各組大鼠心肌組織中SOD、CK、LDH水平比較(n=12±s)

表1 各組大鼠心肌組織中SOD、CK、LDH水平比較(n=12±s)

組別 SOD(U/ml) CK(IU/L) LDH(IU/L)I/R組72.9±6.9 92.1±10 7103.5±734.8 Res+I/R組 4.8±9.71) 72.1±8.41) 4 701.3±531.61)Res+ex527+I/R組 76.9±8.52) 92.1±8.92) 7 009.3±798.72)ex527+I/R組 83.7±9.12) 104.3±111.22)7 723.9±932.82)

與I/R組比較:1)P＜0.05;與Res+I/R組比較:2)P＜0.05;下表同

圖2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)(×200)

表2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化(n=12±s)

表2 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化(n=12±s)

組別 Bcl-2 PEI(%) Bax PEI(%)Bax/Bcl-2 I/R組6.3±1.2 13.9±2.6 2.4±0.8 Res+I/R組 20.3±1.91) 14.1±2.51) 0.7±0.21)Res+ex527+I/R組 5.9±0.82) 14.2±3.02) 2.3±0.62)Ex527+I/R組 14.0±2.12) 14.9±3.12) 1.6±0.32)

2.4 各組大鼠I/R心肌組織中sirt1及乙?；痯53蛋白的表達(dá) 與I/R組相比，Res+I/R組sirt1蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)。Res+I/R組乙?；痯53蛋白表達(dá)明顯低于I/R組(P＜0.05)，而與I/R組相比，ex527+Res+I/R組和ex527+I/R組乙酰化p53蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠sirt1和乙?；痯53蛋白表達(dá)

3 討論

隨著心肌梗死發(fā)生率增高和早期冠脈再通治療的廣泛開展，心肌I/R損傷是目前心肌保護(hù)中的重要課題。冠狀動(dòng)脈嚴(yán)重狹窄或阻塞后，早期血管再通和恢復(fù)血流是重要治療措施，但是心肌I/R后可導(dǎo)致心律失常、梗死面積擴(kuò)大及心功能不全等再灌注損傷。心肌細(xì)胞凋亡是I/R損傷的重要形式，研究表明〔6〕，多個(gè)促凋亡通路在該過程中激活。減少受損心肌細(xì)胞的凋亡一直是緩解I/R損傷的重點(diǎn)。本研究結(jié)果證實(shí)，白藜蘆醇預(yù)處理顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率。然而，不同研究對(duì)白藜蘆醇的作用機(jī)制觀點(diǎn)不同。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇的心肌保護(hù)作用與激活sirt1并啟動(dòng)sirt1-p53通路密切相關(guān)。

sirt1是重要的抗衰老蛋白，通過使多個(gè)蛋白去乙?；淖兤浠钚?，涉及細(xì)胞內(nèi)基因沉默、能量代謝、抗細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等多個(gè)生物功能。其中，sirt1能使促凋亡因子p53蛋白的第373、320和382位賴氨酸殘基去乙?；瑥亩种苝53與靶DNA順式原件結(jié)合，進(jìn)而抑制p53促凋亡活性。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，sirt1增加使p53乙?；潭冉档?，進(jìn)而減少促凋亡蛋白Bax表達(dá)和細(xì)胞色素C出線粒體，降低阿柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理通過激活sirt1而降低心肌細(xì)胞內(nèi)包括p53在內(nèi)的蛋白乙?；潭?，進(jìn)而減輕I/R損傷〔8〕。而白藜蘆醇是目前為止發(fā)現(xiàn)的最好的sirt1激活劑，多個(gè)研究表明，其保護(hù)作用與激活sirt1密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇預(yù)處理組sirt1表達(dá)量增加，同時(shí)乙酰化p53含量降低，p53啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的促凋亡蛋白Bax表達(dá)量也降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加。另外，本實(shí)驗(yàn)在白藜蘆醇預(yù)處理時(shí)加入sirt1特異性抑制劑ex527，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ex527加入后乙酰化p53含量較白藜蘆醇預(yù)處理組升高，同時(shí)心肌細(xì)胞凋亡率也升高。從反面證實(shí)白藜蘆醇的保護(hù)作用是通過激活sirt1，進(jìn)而降低p53的乙酰化程度而獲得。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，sirt1除了使p53乙?；潭冉档投鴾p少細(xì)胞凋亡，也通過其他通路促進(jìn)SOD產(chǎn)生而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激。這在其他研究實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)〔9〕。綜上，白藜蘆醇激活sirt1，后者使促凋亡蛋白p53去乙酰化而失活，減少I/R中受損心肌細(xì)胞凋亡。并且激活的sirt1增加心肌組織內(nèi)SOD含量，而減輕心肌細(xì)胞的氧化損傷。

1 陳麗函，王 偉，傅玉才，等.白藜蘆醇對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡及沉寂信息調(diào)節(jié)因子2表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)臨床康復(fù)，2006;10(19):69-71.

2 Samuel SM，Thirunavukkarasu M，Penumathsa SV，et al.Akt/FOXO3a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction:switching gears toward survival and longevity〔J〕.J Agric Food Chem，2008;56(20):9692-8.

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4 Yoshida Y，Shioi T，Izumi T.Resveratrol ameliorates experimental autoimmune myocarditis〔J〕.Circ J，2007;71(3):397-404.

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6 Song JQ，Teng X，Cai Y，et al.Activation of Akt/GSK-3beta signaling pathway is involved in intermedin(1-53)protection against myocardial apoptosis induced by ischemia/reperfusion〔J〕.Apoptosis，2009;14(9):1061-9.

7 Zhang C，F(xiàn)eng Y，Qu S，et al.Resveratrol attenuates doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis in mice through SIRT1-mediated deacetylation of p53〔J〕.Cardiovasc Res，2011;90(3):538-45.

8 Nadtochiy SM，Redman E，Rahman I，et al.Lysine deacetylation in ischemic preconditioning:the role of SIRT1〔J〕.Cardiovasc Res，2011;89(3):643-9.

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