劉 平 李建團(tuán) 穆懷暢 劉金霞 (承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000)

干擾素-α(IFN-α)聯(lián)合病毒唑是目前常用的也是較為有效的治療慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)的方法。然而，其骨髓抑制、抑郁、甲狀腺功能異常等嚴(yán)重不良反應(yīng)，常影響患者的依從性和治療效果，尤其在老年女性患者，甲狀腺功能減退發(fā)生率明顯高于男性和青年患者〔1〕，甚至發(fā)生老年抑郁。本研究通過(guò)檢測(cè)CHC患者應(yīng)用IFN-α過(guò)程中外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)輔助性T細(xì)胞亞群(Th1/Th2)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，探討IFN-α對(duì)Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006～2008年在我科門診或住院病房行IFN治療的54例CHC患者，其中男30例，女24例;年齡18～65〔平均(35.6±16.8)〕歲。在男性患者中，50～65歲15例設(shè)為老年男性組;在女性患者中，50～65歲13例設(shè)為老年女性組;18～50歲26例設(shè)為中青年組。既往無(wú)精神疾病及其他身心疾病等遺傳疾病史。治療前進(jìn)行血、尿常規(guī)、肝功能、丙肝病毒(HCV)抗體、HCV RNA、甲狀腺功能、腎功能、血糖、自身免疫相關(guān)項(xiàng)目等詳細(xì)檢查，嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《丙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》選擇研究對(duì)象，排除其他肝炎病毒和免疫缺陷病毒(HIV)感染〔2〕。另外選擇同期體檢的正常人血清20人份，作為正常對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 應(yīng)用聚乙二醇(PEG)-IFNα-2a 180 μg，每周1次，皮下注射。治療過(guò)程中嚴(yán)密監(jiān)測(cè)患者用藥后不良反應(yīng)，出現(xiàn)自身免疫病、骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)需被迫停藥者，排除在統(tǒng)計(jì)分析范圍內(nèi)。所有病例在應(yīng)用IFN外均應(yīng)用相似的保肝降酶治療藥物，在治療觀察期間沒(méi)有服用其他對(duì)甲狀腺水平有影響的藥物，飲食等。用藥時(shí)間48 w。

1.2.2 標(biāo)本留取 分別在治療前和治療12 w時(shí)空腹抽取患者靜脈血10 ml，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，液氮中保存，備用。

1.2.3 Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè) 采用細(xì)胞總RNA提取Trizol試劑試劑盒，嚴(yán)格按操作指南提取總RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定提取總RNA的濃度，應(yīng)用2 μg總RNA，在20 μl體系中合成cDNA第一條鏈，體系如下:10× buffer2μl，2.5mmol/LdNTP0.25 μl，Oligo(dT)15 primer 1 μl，M-MLV 200 U，RNA 酶抑制劑0.5 μl，42℃ 1 h，92℃ 5 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、干擾素-γ(IFNγ)、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-10引物由上海生工合成，見(jiàn)表1。用所得cDNA進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增內(nèi)參照 β-actin 及 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10的PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1〔3〕。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，Gel-PRO ANALYZER凝膠定量分析軟件進(jìn)行灰度分析，得β-actin及4種細(xì)胞因子灰度值，將4種細(xì)胞因子灰度值分別除以β-actin灰度值，從而得到4種細(xì)胞因子相對(duì)含量(%)。

表1 PCR引物、擴(kuò)增片段大小及擴(kuò)增條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CHC患者治療前與正常對(duì)照組Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的比較 CHC患者與正常對(duì)照組比較，Th1細(xì)胞因子表達(dá)水平較低，而Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平偏高。見(jiàn)表2。

2.2 CHC患者治療12 w后與正常對(duì)照組Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞因子水平比較 IFN治療12 w后，各組患者之間進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)老年女性組Th1細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平明顯升高，與老年男性組和正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與中青年組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，甚至IFN-γ顯著降低。見(jiàn)表2。

2.3 CHC治療前后各組Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化 IFN-α聯(lián)合病毒唑治療12 w時(shí)Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平顯著增高，Th2類細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá)水平與治療前相比無(wú)顯著性變化。見(jiàn)表2。

表2 CHC患者治療前和治療12 w后Th1/Th2表達(dá)水平的變化(± s，%)

表2 CHC患者治療前和治療12 w后Th1/Th2表達(dá)水平的變化(± s，%)

與治療前比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與老年女性組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01;與正常對(duì)照組比較:5)P＜0.05，6)P＜0.01;與老年男性組比較:7)P＜0.05

組別 n IFN-γ治療前 治療后TNF-α治療前 治療后IL-4治療前 治療后IL-10治療前 治療后正常對(duì)照組 20 27.29±5.26 － 24.13±3.55 － 10.0 7±3.33 － 15.52±3.21 －老年女性組 13 19.97±3.256)24.34±5.371)5)18.99±2.386)29.34±5.322)6)8.37±1.695) 9.38±2.38 13.64±3.65 14.30±3.25老年男性組 15 18.31±4.286)22.35±3.562)3)6)21.35±5.245)26.66±3.292)5)10.37±2.054) 9.68±2.25 12.37±2.696) 13.98±2.54中青年組 26 25.54±3.873)7)28.34±3.452)4)22.35±3.843)28.39±4.382)6)12.39±3.264)5)13.34±2.974)6)11.37±3.034)6)13.04±3.085)

3 討論

CD4+T細(xì)胞在宿主抗病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，根據(jù)細(xì)胞因子分泌模式的差異，可分為Th1、Th2兩類。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫反應(yīng);Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫反應(yīng)。IFN在發(fā)揮抗病毒治療過(guò)程中，能夠激起強(qiáng)的Th1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，則病毒被清除;而弱的Th1反應(yīng)常伴隨著病毒的持續(xù)感染和治療失敗〔4，5〕。然而，與此同時(shí)，伴隨著Th1和Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)相互抑制、相互調(diào)節(jié)，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)被打破，機(jī)體不能維持正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可上調(diào)甲狀腺濾泡細(xì)胞主要組織相容抗原大分子的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，促進(jìn)甲狀腺內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并使浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活并釋放IFN-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子及產(chǎn)生氧自由基，從而造成甲狀腺組織的破壞。IL-4主要產(chǎn)生于Th2細(xì)胞，可促進(jìn)IgG2、IgA和IgE等抗體的產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫，最終發(fā)生自身免疫性疾病〔6〕。

在本研究中，使用半定量RT-PCR方法，從基因表達(dá)水平檢測(cè)Th1/Th2平衡的變化，即用外周血單核細(xì)胞中相對(duì)恒量表達(dá)的β-actin為內(nèi)參照，將細(xì)胞因子基因與β-actin基因同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，根據(jù)細(xì)胞因子基因與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物量的比值估算細(xì)胞因子基因的相對(duì)含量。該方法能夠精確地反映機(jī)體免疫功能受到的調(diào)節(jié)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗病毒治療前，老年女性CHC患者IFN-γ、TNF-α的表達(dá)均明顯低于正常對(duì)照組、老年男性組和中青年組。提示CHC患者的細(xì)胞免疫功能下降，病毒清除能力減弱，這可能是造成HCV持續(xù)感染的原因之一。對(duì)IFN-α聯(lián)合病毒唑治療12 w時(shí)的患者進(jìn)行分組分析，發(fā)現(xiàn)老年女性組Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平顯著增高。提示抗病毒治療充分激活了完全應(yīng)答組的Th1型免疫反應(yīng)，患者的細(xì)胞免疫功能得到恢復(fù)，并因此獲得了良好的治療效果。

1 王欣怡，張學(xué)敏，張文彬，等.干擾素致老年丙型肝炎患者抑郁與甲狀腺功能低下的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(9):1194-5.

2 彭文偉.傳染病學(xué)〔M〕.第5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001:15-45.

3 Tsai SL，Sheen IS，Chien RN，et al.Activation of Th1 immunity is a common immune mechanism for the successful treatment of hepatitis B and C:tetramer assay and therapeutic implications〔J〕.J Biomed Sci，2003;10(1):20-35.

4 Abayli B，Canataroglu A，Akkiz H.Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C virus infection〔J〕.Tark J Gastroenterol，2003;14(1):7-11.

5 Aghemo A，Rumi MG，Colombo M.Pegylated IFN-alpha2a and ribavirin in the treatment of hepatitis C〔J〕.Expert Rev Anti Infect Ther，2009;7(8):925-35.

6 張文彬，王欣怡，劉金霞.聚乙二醇干擾素致老年女性丙型病毒性肝炎患者抑郁癥狀分析〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010;30(11):1495-6.