韓玲玲， 李 佳， 陳 穎， 王 威， 張 丹， 劉國良△

(1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110001;2中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 沈陽 110032;3沈陽市93303部隊(duì)醫(yī)院，遼寧 沈陽 110043)

2型糖尿病發(fā)生的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭。研究表明，高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)胰島素抵抗的重要致病因素。游離脂肪酸抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激后的組織攝取與利用葡萄糖，造成組織對胰島素的敏感性降低。骨骼肌是機(jī)體葡萄糖、脂質(zhì)攝取和利用的重要器官，因而骨骼肌的脂肪沉積與骨骼肌胰島素抵抗的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注［1，2］。本研究將給予原代培養(yǎng)的大鼠成肌細(xì)胞不同劑量棕櫚酸(palmitic acid，PA)處理不同時間，通過檢測細(xì)胞活力、甘油三酯在細(xì)胞中的沉積及含量，以及葡萄糖攝取的變化，以探討棕櫚酸造成大鼠成肌細(xì)胞的脂毒性，并進(jìn)一步研究其對成肌細(xì)胞糖代謝的影響。

材料和方法

1 主要儀器與試劑

超凈工作臺(蚌埠凈化設(shè)備廠)，CO2孵箱(Forma Scientific)，超高速離心機(jī)(Sanyo)，倒置相差顯微鏡(Nikon)，低溫離心機(jī)(Sigma)，負(fù)壓吸引器(Millipore)，酶標(biāo)儀(Bio－Rad)，多功能液閃發(fā)光測定儀(Perkinelmer)。

PA(Sigma)，DMEM 和胎牛血清(HyClone)，膠原酶Ⅰ和牛血清白蛋白(Sigma)，油紅O干粉(Solarbio)，兔抗大鼠α－肌動蛋白抗體、山羊抗兔多克隆抗體及過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(北京博奧森)，甘油三酯［甘油磷酸氧化酶－過氧化物酶(glycerophosphate oxidase－peroxidase，GPO －POD)法］測定試劑盒(北京普利萊)，［3H］標(biāo)記－2－脫氧 －左旋 －葡萄糖(2－deoxy－D－［3H］glucose)(Perkinelmer)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

2 方法

2.1 大鼠成肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定 取Wistar乳鼠4只，在無菌條件下分離雙下肢及腹部肌肉，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，I型膠原酶消化40 min后，0.25%胰蛋白酶消化30 min，過200 μm孔徑的濾網(wǎng)，1000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以109cells/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后，胰酶消化，以2×109cells/L的細(xì)胞密度，重新接種于75 cm2的大培養(yǎng)瓶。以后每2－3 d換液1次。待細(xì)胞處于80% ～90%融合狀態(tài)時，用含0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，差速貼壁法純化。將細(xì)胞接種于24孔板后，用兔抗大鼠α－肌動蛋白抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定，見圖1，成肌細(xì)胞α－肌動蛋白在胞漿內(nèi)被染成黃色。

2.2 PA處理細(xì)胞及測定指標(biāo) 原代培養(yǎng)細(xì)胞處于80% ～90%融合狀態(tài)時用0.1、0.3、0.5 mmol/L PA處理6、12、24 h 后，用 MTT 法檢測成肌細(xì)胞活力［3］;用油紅O染色法檢測成肌細(xì)胞脂肪變性后甘油三酯沉積［4］;用GPO－POD酶法測定成肌細(xì)胞脂肪變性后甘油三酯含量［5］;用同位素示蹤法檢測2－deoxy－D －［3H］glucose攝取［6］。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析(One－way ANOVA)進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)(SNK)。

Figure 1.Rat myoblast immunohistochemistry staining revealed that the cultured cells were rat myoblasts(×200).The rat α－actin was stained as yellow in the cytoplasm of myoblasts.圖1 大鼠成肌細(xì)胞的免疫組化鑒定

結(jié) 果

1 PA對成肌細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，隨著 PA處理濃度(0.1～0.5 mmol/L)的增加及暴露時間(6～24 h)的延長，成肌細(xì)胞活力不斷降低，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性的效應(yīng)關(guān)系。0.1 mmol/L PA未對細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響，0.3 mmol/L PA暴露時間6、12 h亦未對細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯影響，但該劑量暴露24 h使細(xì)胞活力明顯下降。0.5 mmol/L PA在3個暴露時點(diǎn)段均使細(xì)胞活力顯著下降。

Figure 2.MTT method showed the effect of PA on the cell viability of myoblasts..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖2 MTT法檢測PA對成肌細(xì)胞活力的影響

2 PA對成肌細(xì)胞甘油三酯沉積的影響

油紅O染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)橘紅色的脂滴表示甘油三酯沉積。正常培養(yǎng)的細(xì)胞(未加PA)中未見甘油三酯沉積。如圖3所示，隨著PA暴露劑量和時間增加，甘油三酯沉積逐漸增加。但是各劑量PA組培養(yǎng)6 h，細(xì)胞內(nèi)可見少量脂肪變性細(xì)胞，脂滴數(shù)量較少。除0.1 mmol/L PA培養(yǎng)12和24 h外，各組脂變細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴沉積，部分脂滴融合。

Figure 3.Oil red O dyeing method showed that palmitic acid induced TG sediment in myoblasts(×400).圖3 油紅O染色顯示PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯沉積

3 PA對成肌細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的影響

如表1所示，與對照相比，甘油三酯含量隨PA濃度增加、作用時間延長而增加。在0.3 mmol/L PA(12、24 h)組和 0.5 mmol/L PA(6、12、24 h)組有明顯甘油三酯沉積。

表1 GPO－POD法測定大鼠成肌細(xì)胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

表1 GPO－POD法測定大鼠成肌細(xì)胞中甘油三酯含量Table 1.GPO－POD method was used to determinate the triglyceride content in myoblasts(mmol/L..n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs 0.1 mmol/L PA;△P＜0.05 ，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 1.023 ±0.468 1.046 ±0.320 1.053 ±0.3970.1 mmol/L PA 1.183 ±0.370 1.687 ±0.623 1.951 ±0.748＊△0.3 mmol/L PA 1.317 ±0.329 3.277 ±0.503＊＊##△△ 3.955 ±0.836＊＊##△△0.5 mmol/L PA 2.547 ±0.493＊＊## 5.725 ±0.807＊＊##△△ 6.296 ±0.596＊＊##△△

4 PA對成肌細(xì)胞糖攝取的影響

如表2所示，與對照相比，隨PA濃度升高、作用時間延長，大鼠成肌細(xì)胞糖攝取減低，但24和12 h無顯著差異。0.1 mmol/L PA(24 h)組、0.3 mmol/L PA(12、24 h)組及0.5 mmol/L PA(12、24 h)組的大鼠成肌細(xì)胞糖攝取顯著減低，見表2。

表2 同位素示蹤法檢測大鼠成肌細(xì)胞糖攝取情況Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

表2 同位素示蹤法檢測大鼠成肌細(xì)胞糖攝取情況Table 2.Isotope tracer method was used to detect the 2－deoxy－D－［3H］glucose uptake of rat myoblasts(10－2pmol/min..n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs 0.1 mmol/L PA;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 6 h.

Group 6 h 12 h 24 h Control 2.300 ±0.502 2.250 ±0.409 2.233 ±0.2940.1 mmol/L PA 2.267 ±0.468 1.950 ±0.362 1.683 ±0.264＊＊△0.3 mmol/L PA 2.183 ±0.349 1.583 ±0.534＊＊△ 1.417 ±0.299＊＊△△0.5 mmol/L PA 2.150 ±0.288 1.450 ±0.404＊＊△△ 1.183 ±0.397＊＊#△△

討 論

近年的研究表明，血清游離脂肪酸升高和甘油三酯在非脂肪組織的異位沉積與這兩個環(huán)節(jié)密切相關(guān)［7］。對糖尿病患者的非肥胖非糖尿病后代研究表明，肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的增多可作為導(dǎo)致胰島素抵抗發(fā)生的早期異常改變，并提示此異常改變可導(dǎo)致該個體葡萄糖攝取障礙［8］。骨骼肌是葡萄糖代謝的重要組織，骨骼肌的胰島素敏感性降低是機(jī)體胰島素抵抗的主要原因。骨骼肌脂質(zhì)分布與含量異常，及骨骼肌異位脂肪的過多沉積，被認(rèn)為是胰島素抵抗的關(guān)鍵因素之一。

本實(shí)驗(yàn)提取3 d齡Wistar大鼠的成肌細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)及鑒定后，應(yīng)用有代表性的游離脂肪酸－不同濃度PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著PA處理濃度和時間的增加，成肌細(xì)胞活力逐漸降低，甘油三酯沉積及細(xì)胞內(nèi)含量逐漸增加，葡萄糖攝取逐漸降低。本研究表明，高游離脂肪酸血癥是肥胖引發(fā)胰島素抵抗的重要致病因素，游離脂肪酸抑制基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激后的組織攝取與葡萄糖利用，造成組織對胰島素的敏感性降低，但是其抑制骨骼肌葡萄糖攝取的環(huán)節(jié)還有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌組織內(nèi)增多的脂肪將比葡萄糖優(yōu)先利用，導(dǎo)致肌細(xì)胞利用葡萄糖能力下降，攝取葡萄糖減少，引起胰島素抵抗。研究還發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸不只是單純通過葡萄糖－脂肪酸循環(huán)與葡萄糖相互競爭，可能還通過其它機(jī)制影響葡萄糖代謝。近來研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌的脂質(zhì)代謝異常與胰島素抵抗以及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因而異位脂肪組織可以作為臨床治療的目標(biāo)，通過不同的治療方法，減少肥胖，延緩和防止胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展，以達(dá)到預(yù)防糖尿病和心血管疾病的目的。

［1］Savage DB，Petersen KF，Shulman GI，et al.Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance［J］.Physiol Rev，2007，87(2):507 －520.

［2］Li Y，Bao Y，Jiang B，et al.Catalpol protects primary cultured astrocytes from in vitro ischemia－induced damage［J］.Int J Dev Neurosci，2008，26(3 －4):309 － 317.

［3］周 華，楊 曦，張雅鷗，等.Ghrelin抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成脂分化［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(8):886－890.

［4］陳 萍，曾方銀，張 鵬.甘油內(nèi)空白法與GPO－POD法檢測血清三酰甘油［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，4(4):261－263.

［5］王 平，母義明，汪保安，等.軟脂酸和花生四烯酸對人干細(xì)胞瘤細(xì)胞株細(xì)胞葡萄糖攝取的影響［J］.中華糖尿病雜志，2005，13(2):140 －141.

［6］Boden G.Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM［J］.Diabetes，1997，46(1):3 －10.

［7］Jacob S，Machann J，Rett K，et al.Association of increased intramyocellular lipid concent with insulin resistance in lean nondiabetic offspring of type 2 diabetic subjects［J］.Diabetes，1999，48(5):1113 －1119.