楊開焰 陳道瑾 李小榮 吳 唯 (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院普外科，湖南 長沙 410013)

RhoA是ras相關(guān)的小分子GTP酶超家族Rho亞家族成員，其生物學(xué)作用的基礎(chǔ)是通過改變細胞骨架肌動蛋白的結(jié)構(gòu)，進而調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、極性、增殖、細胞黏附和細胞凋亡等多種生物學(xué)行為〔1〕。近年來研究提示RhoA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用〔2，3〕。目前，有關(guān)RhoA與惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系研究尚少，本研究應(yīng)用針對RhoA編碼區(qū)設(shè)計小干擾RNA(siRNA)片段，構(gòu)建靶向RhoA的shRNA真核表達載體以研究其對結(jié)腸癌細胞惡性表型的影響，探討了RhoA基因表達與結(jié)腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，從而為結(jié)腸癌的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 大腸癌LoVo細胞株來自中南大學(xué)湘雅中心實驗室。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(Gbico)，小牛血清(杭州四季青)，Lipofeetamine 2000(Invitrogen)，Opti-MEN I(Gbico)，RT-PCR kit(QIAGEN)，TRIzol(Invitrogen)，二甲基亞砜 DMSO(Sigma)。鼠抗人GAPDH單克隆抗體，鼠抗人RhoA單克隆抗體(中國臺灣 Abnova)，SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)。

1.1.3 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，酶標(biāo)儀(Bio-TEK，美國)，PCR 儀(Eppendorf，德國)，凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國)。

1.1.4 RhoA siRNA的設(shè)計及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計含有BamHI和PstI雙酶切的RhoA siRNA小發(fā)夾結(jié)構(gòu)干擾序列(NM-001664CDS的 354～384 bp)如下:正義鏈:5-CACC GAAGGATCTTCGGAATGATGA TTCAAGAGA TCATCATTCCG AAGATCCTTC TTTTTTG-3;反義鏈:5-GATCCAAAAAA GAAGGATCTTCGGAATGATGA TCTCTTGAA TCATCATTCCG AAGATCCTTC-3。用T4連接酶將雙鏈寡核苷酸與pGPU6/GFP/Neo線性載體定向連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選卡那霉素抗性菌落并擴增培養(yǎng)，然后快速小量制備質(zhì)粒并行核酸測序鑒定(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成)。RhoA干擾重組質(zhì)粒命名為PshRNA-RhoA，陰性對照質(zhì)粒命名為pshRNA-NC。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人結(jié)腸癌LoVo細胞，待細胞長到90%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基吹散細胞，把細胞調(diào)整到一定的數(shù)目，進行以下的實驗研究。

1.2.2 重組體轉(zhuǎn)染LoVo細胞及陽性克隆的篩選及鑒定 3×105個LoVo細胞接種于6孔板，其融合度達90%時分別用PshRNA-RhoA和pshRNA-NC進行轉(zhuǎn)染。48 h后按1∶6稀釋傳代并換用選擇培養(yǎng)基(400 μg/ml維持濃度)篩選14 d，將出現(xiàn)的細胞克隆在培養(yǎng)板中擴增培養(yǎng)并傳代建株，命名為PshRNARhoA細胞和pshRNA-NC細胞。

1.2.3 RhoA siRNA對LoVo細胞RhoA表達的影響 實驗分3組:LoVo、PshRNA-RhoA細胞組和pshRNA-NC細胞，每組細胞設(shè)3個復(fù)孔。(1)實時定量PCR:分別收集各組細胞1×106個，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，進行實時定量 PCR反應(yīng)。RhoA上游引物:5'-agttcccagaggtgtatgtg-3';下游引物:5'-ggacagaaatgcttgacttc-3'，擴增產(chǎn)物238 bp。內(nèi)參照beta-actin上游引物:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3';下 游 引 物:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，擴增產(chǎn)物285 bp。反應(yīng)條件:95℃ 10 s;61℃ 45 s，61℃ 10 s，共40個循環(huán)。設(shè) LoVo細胞為內(nèi)對照，根據(jù)2－ΔΔCT公式分別計算 PshRNA-RhoA細胞和pshRNA-NC細胞中RhoA mRNA相對于LoVo細胞的表達量。(2)Western印跡:用細胞裂解液裂解細胞，裂解液煮沸5 min后進行Western印跡分析，一抗分別用鼠抗人GAPDH單克隆抗體(中國臺灣Abnova，1∶1 000稀釋)和鼠抗人RhoA單克隆抗體(中國臺灣 Abnova，1∶1 000稀釋)，二抗用 HRP-羊抗鼠IgG，分別用DAB及NBT/BCIP顯色。

1.2.4 細胞黏附實驗 每孔100 μl纖維連接蛋白(10 μg/ml)包被96孔板，以100 μg/ml多聚賴氨酸和1%牛血清清蛋白包被孔作為最大和最小黏附參照。將LoVo/silence(+)和LoVo/silence(－)細胞分別制備成5×105個/ml細胞懸液，每孔加入100 μl，37℃、5%CO2、飽和濕度孵育 3 h。磷酸鹽緩沖液洗滌除去未黏附細胞，多聚甲醛固定，1%亞甲藍溶液染色20 min;每孔加入 100 μl 1 mol/L HCl，37℃ 40 min，酶標(biāo)儀測定 600 nm處吸光度值(A值)，細胞黏附率=(實驗組A值－牛血清白蛋白孔A值)/(多聚賴氨酸孔A值－牛血清白蛋白孔A值)×100%。

1.2.5 Matrigel侵襲實驗 在Transwell上室加入100 μl Matrigel，37℃孵育2 h，分別加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的LoVo干擾組和LoVo陰性對照組細胞1×105個，下室加入1 ml含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。取出小室，上室用棉簽擦凈膜上未侵襲的細胞以及Matrigel膠，95%酒精固定15 min，蘇木素染色細胞核10 min，取下濾膜，200倍光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野計數(shù)細胞，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，相同時間兩實驗組之間采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RhoA mRNA表達的變化 LoVo細胞在轉(zhuǎn)染PshRNARhoA后，與陰性對照組(5.87% ±0.57%)相比，RhoA mRNA表達量明顯下降，抑制率達74.87% ±3.24%。

2.2 Western印跡檢測RhoA蛋白表達 Western印跡檢測各組細胞RhoA蛋白表達(圖1)，pshRNA-RhoA細胞RhoA蛋白的表達量較未轉(zhuǎn)染LoVo細胞減少，經(jīng)灰度值分析其RhoA的相對表達量是未轉(zhuǎn)染LoVo細胞的36.93%。

2.3 細胞黏附實驗 PshRNA-RhoA轉(zhuǎn)染組黏附率為9.24%±2.54%，陰性對照組為42.83% ±1.37%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 各組RhoA的Western印跡檢測結(jié)果

2.4 細胞侵襲實驗 轉(zhuǎn)染RhoA shRNA重組質(zhì)粒后，LoVo細胞透膜細胞數(shù)(26.5±0.9)個明顯低于陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞透膜細胞數(shù)(53.7±1.4)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 細胞侵襲試驗結(jié)果(HE，×200)

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最基本的生物特征，是一系列具有內(nèi)在聯(lián)系的多個步驟相互作用的結(jié)果，其中包括腫瘤細胞的侵襲、遷移、種植等，每個步驟又是由多個因素的共同參與的，因而其具有復(fù)雜性。它是目前腫瘤患者死亡的主要原因，因此，對腫瘤轉(zhuǎn)移的研究是腫瘤學(xué)研究中最受關(guān)注的前沿之一。Rho亞家族是一組分子量為20～30 kD的鳥苷酸結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，RhoA、RhoB和RhoC高度同源，約有85%的氨基酸序列相同〔4，5〕。研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織的中RhoA的表達量較相應(yīng)正常對照組織高，且在RhoA表達陽性的病例中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高〔6～9〕，這在本研究的前期研究中也得到了證實，說明了RhoA基因在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用。故此，本研究成功設(shè)計了靶向RhoA的shRNA表達載體，轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌LoVo細胞，并進一步觀察了其對細胞黏附與侵襲等生物學(xué)行為的影響。

RNA干擾(RNAi)是自然界生物體的一種遺傳現(xiàn)象，可以誘導(dǎo)目的基因沉默，高效、特異地抑制目的基因。RNAi具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢，包括特異性、高效性和可傳播性，自發(fā)現(xiàn)以來，已廣泛應(yīng)用于基因功能、腫瘤和病毒性疾病治療等的研究〔10〕。LoVo細胞屬于高表達RhoA基因的人結(jié)直腸癌細胞。通過構(gòu)建靶向PshRNA-RhoA真核表達載體，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌LoVo細胞，通過實時定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)干擾組細胞的RhoA mRNA表達量和蛋白量均比正常LoVo細胞下降，其在mRNA水平對RhoA的抑制率達到74.87%，陰性對照組的 siRNA對 RhoA的表達無明顯影響(5.87%)，這說明LoVo細胞內(nèi)RhoA基因已成功的被敲低，我們構(gòu)建的siRNA不僅作用強大而且具有特異性。在此研究的基礎(chǔ)上，體外黏附實驗表明細胞在轉(zhuǎn)染PshRNA-RhoA表達載體后，細胞黏附能力下降，說明RhoA與結(jié)直腸癌細胞的黏附能力相關(guān)。侵襲實驗結(jié)果顯示RhoA表達被抑制后，穿過人工基底膜的細胞數(shù)明顯少于陰性對照組，表明RhoA蛋白表達量與結(jié)直腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。以上證據(jù)表明，RhoA可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，RhoA可能被作為腫瘤基因治療的新靶點進行研究中具有重要的潛在價值。但shRNA在體內(nèi)對RhoA基因表達和結(jié)直腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響尚待研究。

1 Chang YW，Bean RR，Jakobi R.Targeting RhoA/Rho kinase and p21-activated kinase signaling to prevent cancer development and progression〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2009;4(2):110-24.

2 Bouzahzah B，Albanese C，Ahmed F，et al.Rho family GTPases regulate mammary epithelium cell growth and metastasis through distinguishable pathways〔J〕.Mol Med，2001;7(12):816-30.

3 Li XR，Ji F，Ouyang J，et al.Overexpression of RhoA is associated with poor prognosis in hepatocellular carcinoma〔J〕.EJSO，2006;32(10):1130-4.

4 Kimura K，Tsuji T，Takada Y，et al.Accumulation of GTP-bound RhoA during cytokinesis and acritical role of ECT2 in this accumulation〔J〕.J Biol Chem，2000;275(23):17233-6.

5 Hall A.Rho GTPases and the actin cytoskeleton〔J〕.Science，1998;279(5350):509-14.

6 Yoji Takami，Morihiro Higashi，Shinpei Kumagai，et al.The activity of RhoA is correlated with lymph node metastasis in human colorectal cancer〔J〕.J Dig Dis Sci，2008;53(2):467-73.

7 王 顥，陳玉霞，曹冬梅，等.RhoA基因在結(jié)直腸癌組織中的表達〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002;05(82159):348-51.

8 Fritz G，Just I，Kaina B.Rho GTPases are over-expressed in human tumors〔J〕.Int J Cancer，1999;81(5):682-7.

9 Yoshioka K，Nakamori S，Itoh K.Overexpression of small GTP-binding protein RhoA promotes invasion of tumor cells〔J〕.Cancer Res，1999;59(8):2004-10.

10 Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells〔J〕.Science，2002;296(5567):550-3.