王 婷 熊章鄂(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖北 宜昌 443002)

ROS介導(dǎo)的病理損傷與多種年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。在伴有輕度認(rèn)知能力損傷、阿爾茨海默病和血管性癡呆的患者中都可觀察到脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的升高和抗氧化物水平的降低〔1，2〕。二苯乙烯苷(TSG)是從抗衰老中藥蓼科植物何首烏的干燥塊根中提取分離得到的一種多酚結(jié)構(gòu)的水溶性、何首烏的主要有效成分〔3〕。研究表明，TSG具有抗氧化和清除自由基的作用〔4〕。嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系(PC12)細(xì)胞是來自大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤的克隆細(xì)胞系，作為細(xì)胞模型已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的研究。本研究采用H2O2損傷的體外培養(yǎng)模型，觀察TSG對H2O2誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞系氧化損傷的保護(hù)作用，為其應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病的治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 TSG(C20H22O9)，分子量:406，純度大于98%，購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，胰酶購自Gibco公司。MTT，DCFH-DA購自Molecular Probes公司。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系陳建國教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保種。使用含10%FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，在37℃，95%O2和5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天全量更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，按1∶4的比例將細(xì)胞傳代至多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，以備實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞存活率 細(xì)胞按合適的密度接種于96孔板，隨機(jī)分為:正常對照組、H2O2處理組和 TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)組。加入不同濃度的TSG預(yù)孵育細(xì)胞12 h后，再加入120 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。在避光條件下，每孔加入MTT 0.5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加DMSO 100 μl，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀上測波長為490 nm時(shí)的吸光度值(A)。A值為活細(xì)胞將MTT還原為藍(lán)色結(jié)晶物formazan的光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)成正比，間接反映活細(xì)胞數(shù)。各組細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%，從而得出各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測定 細(xì)胞按合適的密度接種于96孔板，分組及處理同上。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。DCF的熒光強(qiáng)度用Cytofluor2350熒光酶標(biāo)儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長525 nm，DCFH的熒光代表了細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性及MDA含量的測定 胰酶消化收集細(xì)胞后用超聲裂解細(xì)胞，獲取細(xì)胞勻漿。SOD活性測定依據(jù)黃嘌呤氧化酶法的原理，GSH-Px的活性測定根據(jù)Mill's法，MDA含量的檢測依據(jù)硫代巴比妥酸(TBA)法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用x± s表示，多組間顯著性比較用單因素方差分析(ANOVA)結(jié)合Duncan's檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1 TSG抑制 H2O2誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞損傷 120 μmol/L H2O2作用24 h后，PC12細(xì)胞的存活率(0.36±0.05)降低到正常對照組的〔0.67±0.04，(54±6)%〕。TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞12 h能夠濃度依賴性的降低H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，其存活率分別為0.37±0.02，0.43±0.03，0.51 ±0.06，0.55 ±0.03。

2.2 TSG降低H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高 H2O2處理PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)DCF熒光明顯增強(qiáng)(6 182±392)，為正常對照組(3 454±321)的180% ±10%，提示細(xì)胞內(nèi)ROS 水平增高。不同濃度的 TSG(0.1，1，10，50 μmol/L)預(yù)孵育細(xì)胞12 h后，再用120 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞，能夠劑量依賴性的拮抗H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)DCF熒光增高。其ROS的DCF熒光強(qiáng)度分別為6 148±241，5 320±274，4 870±310及4 697±238。

2.3 TSG對PC12細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響 H2O2處理PC12細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px的活性減少。TSG預(yù)處理12 h可以明顯對抗H2O2誘導(dǎo)的抗氧化損傷作用。見表1。

表1 TSG對PC12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的影響(，n=6)

表1 TSG對PC12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的影響(，n=6)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別SOD(U/mgpro)GSH-Px(U/mgpro)MDA(nmol/mgpro)28.0±2.7 47.1±6.6 4.3±0.5 H2O2模型組 15.7±1.91)24.9±3.81) 7.6±0.81)H2O2+TSG 0.1 μmol/L組 15.9±2.2 25.8±3.1 7.4±0.7 H2O2+TSG 1 μmol/L組 17.1±2.3 28.7±4.3 6.7±0.42)H2O2+TSG 10 μmol/L組 19.8±1.93)35.7±3.73) 6.5±0.53)H2O2+TSG 50 μmol/L組 21.6±2.53)39.5±2.83) 5.6±0.53)正常對照組

2.4 TSG對PC12細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的影響 H2O2處理PC12細(xì)胞24 h后，使細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量增加，不同濃度的TSG預(yù)處理細(xì)胞后可逆轉(zhuǎn)H2O2所致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量增加。見表1。

3 討論

氧化應(yīng)激是細(xì)胞氧化-抗氧化失衡而導(dǎo)致的應(yīng)激損傷狀態(tài)。當(dāng)ROS的生成增加而其清除減少或者對氧化修飾的大分子修復(fù)減少時(shí)，氧化應(yīng)激就會發(fā)生。ROS的過度產(chǎn)生可以導(dǎo)致一系列的細(xì)胞功能損傷。氧化應(yīng)激對神經(jīng)元的損傷主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面;細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，膜磷脂被破壞降解;細(xì)胞膜對鈉、鈣及大分子物質(zhì)通透性增加，神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞毒性水腫〔5〕;線粒體破壞，功能喪失〔6〕。攻擊細(xì)胞內(nèi)的 RNA和DNA，影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)過程〔7〕。

H2O2是一種膜通透性的ROS，是研究氧化應(yīng)激的理想模型。本研究采用H2O2損傷的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型研究了TSG的細(xì)胞保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從何首烏中提取的單體成分TSG能提高H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的存活率，減輕細(xì)胞損傷。同時(shí)，減輕細(xì)胞內(nèi)ROS累積，增強(qiáng)抗氧化酶SOD和GSH-Px的酶活性，降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量。因此推測，TSG對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用部分是通過抑制胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。

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