王懷穎 石少慧 張晶晶 張 悅 史建紅 (河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，河北 保定 071000)

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程，在維持機(jī)體生理穩(wěn)態(tài)和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也參與多種疾病的病理過程。caspase蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中一個關(guān)鍵分子，是細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一〔1〕。四君子湯是益氣健脾的經(jīng)典方劑，源于宋代《太平惠民和劑局方》。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方能提高機(jī)體抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)代謝、內(nèi)分泌及免疫功能等〔2〕。本實(shí)驗(yàn)擬觀察四君子湯對衰老小鼠腦組織caspase-3表達(dá)及活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級雄性KM小鼠，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號804064)。

1.1.2 藥品及試劑 caspase-3一抗購自Santa Cruz公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，caspase-3檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 四君子湯制備 四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草按2∶2∶2∶1組成，剪碎、浸泡、水煎，收集濾液，濾渣再次加水煎煮，合并兩次濾液，濃縮至2 g/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 動物分組 雄性KM小鼠分為青年對照組(3月齡)、老年對照組(12月齡)和四君子湯組(12月齡)，每組10只。四君子湯組每日灌胃四君子湯12 g/kg，其余兩組灌胃等量蒸餾水，共8 w。8 w后，斷頭處死動物，冰臺上剝離一側(cè)海馬，置4%多聚甲醛溶液固定。剝離另一側(cè)腦組織－70℃冰箱保存，待檢測caspase-3活性。

1.2.2 免疫組化法檢測海馬caspase-3表達(dá) 固定的海馬組織石蠟包埋，5 μm 切片，脫蠟至水，3%H2O210 min，37 ℃抗原修復(fù)10～20 min，血清封閉20 min，滴加caspase-3一抗，4℃過夜。再依次滴加生物素偶聯(lián)的二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片，光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，陽性信號以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷。

1.2.3 免疫組化評分方法 參照文獻(xiàn)〔3〕，結(jié)合陽性細(xì)胞百分比及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱兩個方面評分:a為陽性細(xì)胞百分比(無陽性細(xì)胞 =0，陽性細(xì)胞1% ～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b為陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱(陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強(qiáng)陽性=3)，ab兩項(xiàng)乘積為該例組織的免疫組化評分。

1.2.4 腦組織caspase-3活性測定 取一側(cè)腦組織加入適量裂解液制備成組織勻漿。4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行測定。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。蛋白定量用Bradford法。

2 結(jié)果

2.1海馬caspase-3表達(dá) caspase-3主要在小鼠海馬錐體神經(jīng)元胞質(zhì)表達(dá)。老年小鼠海馬caspase-3陽性細(xì)胞明顯多于青年對照組(P＜0.05)。與老年對照組比較，四君子湯組小鼠海馬caspase-3表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 腦組織caspase-3活性 與青年對照組比較，老年小鼠腦組織caspase-3活性升高，有顯著性差異(P＜0.01)。四君子湯組小鼠腦組織caspase-3活性顯著低于老年對照組(P＜0.01)。見表2。

表1 不同組別小鼠海馬caspase-3表達(dá)的變化(n=5)

表2 不同組別小鼠腦組織caspase-3活性的比較(，n=10)

表2 不同組別小鼠腦組織caspase-3活性的比較(，n=10)

1)與青年對照組比較，P＜0.01，2)與老年對照組比較P＜0.01

組別 caspase-3活性(U/mgprot)22.064±4.640老年對照組 39.492±9.9501)四君子湯組 21.170±5.7152)青年對照組

圖1 各組小鼠海馬caspase-3表達(dá)(DAB，×400)

3 討論

研究表明，進(jìn)入老齡，心、腦、肝等多種組織器官細(xì)胞凋亡過度增加，導(dǎo)致相應(yīng)組織器官功能下降，進(jìn)一步加快衰老進(jìn)程，因此細(xì)胞凋亡是衰老發(fā)生的一個重要原因〔4，5〕。細(xì)胞凋亡的發(fā)生最終依賴caspase家族蛋白酶的活化，其中caspase-3是多條細(xì)胞凋亡途徑的交匯點(diǎn)，是凋亡信號的主要執(zhí)行者。

Caspase-3以酶原形式存在于胞質(zhì)中，被激活后，可水解多種胞質(zhì)、胞核蛋白，破壞細(xì)胞骨架蛋白及與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮，DNA裂解，形成凋亡小體〔6〕。Baker等發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠增齡過程中跖肌 caspase-3，caspase-8，caspase-9表達(dá)增多，其活性高低與肌肉減少程度呈正相關(guān)〔7〕，說明caspase-3活性高低可反映細(xì)胞凋亡速度。本研究顯示，增齡過程中，實(shí)驗(yàn)動物海馬均有caspase-3表達(dá)，腦組織可檢測出caspase-3活性。老齡小鼠腦組織caspase-3表達(dá)及活性均高于青年對照組。

四君子湯是中醫(yī)學(xué)健脾益氣的代表方劑，有“輕身延年”之功效，楊靖等發(fā)現(xiàn)四君子湯能拮抗自由基損傷，減少D-半乳糖衰老模型小鼠多種組織氧化應(yīng)激水平〔2〕。自然衰老小鼠補(bǔ)充四君子湯后，可顯著抑制海馬caspase-3表達(dá)，降低腦組織caspase-3活性，減慢細(xì)胞凋亡速度。本研究認(rèn)為，四君子湯可減少或抑制腦組織神經(jīng)元細(xì)胞過度凋亡，達(dá)到延緩衰老的目的。

1 Chen XX，Li J，Wu JR，et al.Effects of mild hypothermia on levels of Bcl-2，caspase-3 and apoptotic neurosin hippocampus CA1area after forebrain ischemia in gerbils〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2007;23(1):77-81.

2 楊 靖，詹向紅，孫 曄，等.四君子湯對D-半乳糖衰老模型小鼠心、肝、腦組織MDA含量及端粒酶活性的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005;25(6):531-3.

3 Geng YJ，Ishikawa Y，Vatner DE，et al.Apoptosis of cardic myocytes in Gsalpha transgenic mice〔J〕.Circ Res，1999;84(1):34-42.

4 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors〔J〕.Cancer，2000;89(12):2637-45.

5 裴 媛，李德新，孫松輝.獨(dú)活及其醇提取物對自然衰老小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2005;25(8):959.

6 Granville DJ，Shaw JR，Leong S，et al.Release of cytochrome c，Bax migration，Bid cleavage，and activation of caspase2，3，6，7，8 and 9 during endothelial cell apoptosis〔J〕.Am J Pathol，1999;155(4):1021-5.

7 Baker DJ，Hepple RT.Elevated caspase and AIF gene expression correlatewith progression of sarcopenia during aging in male F344BN rats〔J〕.Exp Gerontol，2006;41(11):1149-56.