劉鶴松 張可佳 吳 杰 趙自然 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科，吉林 長(zhǎng)春 300)

細(xì)胞凋亡在病理性瘢痕(PS)形成中起著重要的作用。人參皂苷-Rg3(GS-Rg3)是從人參中分離提純的一種單體，為四環(huán)三萜類人參二醇型皂苷〔1〕。大量研究表明GS-Rg3能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制其轉(zhuǎn)移。Bc1-2是一種凋亡抑制基因，其編碼蛋白能抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡，并能在生長(zhǎng)因子缺乏時(shí)延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，甚至使細(xì)胞“永生化”〔2〕。Bax是在人前白細(xì)胞基因文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一種凋亡相關(guān)基因，基本生物學(xué)特性是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這一作用受Bcl-2的調(diào)節(jié)〔3〕。本實(shí)驗(yàn)擬研究人參皂苷-Rg3對(duì)兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax蛋白質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 大耳白兔24只，雌雄不拘，體重(2.5±0.2)kg，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。根據(jù)時(shí)間分為2 w、4 w、6 w 及對(duì)照組。

1.2 主要儀器及試劑 主要儀器:高精度輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購(gòu)自日本的LAICA。電熱恒溫干燥箱購(gòu)自中國(guó)上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠。石蠟包埋機(jī)、恒溫孵化箱購(gòu)自日本的SANYO。顯微鏡購(gòu)自日本的OLYMPUS。CO2孵箱購(gòu)自美國(guó)SHEL LAB;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD。免疫組化試劑盒、DAB顯示試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。主要試劑:GS-Rg3來(lái)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)、0.01 mol/L(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)為吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院配制。

1.3 動(dòng)物模型的制備 用速眠新注射液0.2～0.3 ml/kg，肌肉注射。麻醉生效后，強(qiáng)力消毒碘消毒兔耳腹面皮膚，切除2 cm×2 cm的全層皮膚，每耳4～6處，創(chuàng)可貼包扎創(chuàng)面。將動(dòng)物編號(hào)，分籠飼養(yǎng)。3 w后創(chuàng)面形成凸起的增生性瘢痕組織。于四組動(dòng)物耳部增生性瘢痕組織處行局部封閉注射，實(shí)驗(yàn)組注射GS-Rg3(濃度6 mg/2 ml)，對(duì)照組注射等體積的0.9%生理鹽水，每3 d一次。分別于用藥后2 w、4 w、6 w切取瘢痕組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定48～72 h，石蠟包埋切片。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 所取瘢痕組織立刻經(jīng)4%多聚甲醛-0.01 mol/L PBS(pH7.4)固定。6 h后，PBS漂洗4～5 h，每小時(shí)交換洗液，或4℃冰箱過(guò)夜。經(jīng)乙醇常規(guī)脫水，二甲苯透明后。浸蠟、包埋。用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，每片標(biāo)本4 μm厚，HE染色、免疫組化法中的鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(SP法)染色。PBS陰性對(duì)照。

1.5 結(jié)果判定 免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色或棕黑色顆粒。每例切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野的平均陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 兔耳增生性瘢痕大體觀察 兔耳腹側(cè)創(chuàng)面1 w左右上皮化，局部逐漸突起，圓形、淡紅色、質(zhì)硬。上皮化后3 w左右，增生厚度為兔耳腹側(cè)皮膚全層厚度的3～4倍。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，60 d左右瘢痕開始逐漸軟化，體積縮小，逐漸趨于平復(fù)。而對(duì)照組繼續(xù)處于增生狀態(tài)。

2.2 GS-Rg3對(duì)兔耳增生性瘢痕中Bcl-2、Bax表達(dá)的影響GS-Rg3可明顯降低Bcl-2的表達(dá)水平，用藥后2 w開始表達(dá)量逐漸下降，6 w明顯減少;而對(duì)照組有較多量的Bcl-2表達(dá)。GSRg3可明顯增加Bax的表達(dá)，用藥后2 w開始表達(dá)量明顯增加，而對(duì)照組則有少量表達(dá)。見圖1、表1。Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Ced-9 等。這些家族的成員可形成同源或異源二聚體，調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡和存活。Bax是在人前白細(xì)胞基因文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一種凋亡相關(guān)基因，定位表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，在部分組織中與Bcl-2同時(shí)表達(dá)，并且Bax也不是總表達(dá)于細(xì)胞凋亡率高的組織。Bax的基本生物學(xué)特性是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這一作用受 Bcl-2、Bcl-xl、Bad 調(diào)節(jié)。

表1 增生性瘢痕用藥前后Bcl-2、Bax表達(dá)比較(%，，n=24)

表1 增生性瘢痕用藥前后Bcl-2、Bax表達(dá)比較(%，，n=24)

與用藥前比較:1)P＜0.01

56.92±10.56 8.37±1.29用藥后2 w 27.98±7.311) 12.01±1.711)用藥后4 w 20.25±5.761) 16.89±2.331)用藥后6 w 14.89±3.111) 24.32±3.741)Bcl-2 Bax用藥前時(shí)間

圖1 增生性瘢痕Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化SP法，×40)

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)，分別對(duì)兔耳增生性瘢痕中用藥前后Bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示:GS-Rg3組Bcl-2蛋白質(zhì)在用藥后2 w開始表達(dá)量逐漸下降，6 w明顯減少;而對(duì)照組有較多量的Bcl-2表達(dá)。為了評(píng)價(jià)Bax在增生性瘢痕中的作用，本文利用免疫組化方法檢測(cè)了Bax蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示:用藥后2 w開始表達(dá)量明顯增加，而對(duì)照組則有少量表達(dá)，表明GS-Rg3可導(dǎo)致Bax蛋白質(zhì)表達(dá)增加，這也進(jìn)一步證實(shí)了Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)降低和Bax蛋白質(zhì)表達(dá)增加是導(dǎo)致成纖維細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。這與以往的研究結(jié)果一致，說(shuō)明Bcl-2家族在增生性瘢痕形成和消退過(guò)程中起到非常關(guān)鍵的作用。

Bcl-2基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)可阻止細(xì)胞的凋亡，而Bax基因表達(dá)則有促進(jìn)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax可自身形成二聚體，也可相互作用成為二聚體。Bcl-2/Bax的比率高低也決定細(xì)胞處于凋亡或存活。在Bax缺少的情況下，Bcl-2的過(guò)量表達(dá)能阻止細(xì)胞凋亡。因此Bax和Bcl-2之間既存在競(jìng)爭(zhēng)又能獨(dú)立地調(diào)控細(xì)胞凋亡〔7〕。Bax能在較為廣泛的pH范圍內(nèi)形成離子通道，允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素C等穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡〔8〕。Bcl-2基因表達(dá)異常增加可使已有基因異常改變的成纖維細(xì)胞逃避凋亡，由此引起的基因異常事件的積累是導(dǎo)致瘢痕形成的必要前提。增生性瘢痕是組織損傷后修復(fù)過(guò)度的一種改變，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的大量增生以及膠原等間質(zhì)蛋白的沉積。Ladin等〔9〕發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩和培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高，并伴有細(xì)胞凋亡率降低。Bcl-2調(diào)控機(jī)制至今尚不明了，但有幾種理論已被廣泛承認(rèn):①Bcl-2蛋白作為一種抗氧化劑，控制線粒體膜的膜電位從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡。②Bcl-2與Bax結(jié)合形成雜合二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。③Bcl-2降低線粒體膜對(duì)一些凋亡蛋白前體的通透性，從而使細(xì)胞免于凋亡。④Bcl-2影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+重新分布，而Ca2+激活核酸內(nèi)切酶。⑤通過(guò)蛋白激活放大，使得細(xì)胞骨架及其他小分子化合物發(fā)生改變。本文認(rèn)為通過(guò)與Bax結(jié)合成雜合二聚體，可抑制Bax的促凋亡作用。是否同時(shí)存在其他調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

3 討論

瘢痕增生一直是創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)研究主要從成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制，膠原的合成與降解失衡，大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及三者的相互關(guān)系方面探求產(chǎn)生瘢痕的形成機(jī)制。大量研究表明人參皂苷Rg3作為中藥抗腫瘤藥物具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤新生血管形成等作用〔4〕。

Bcl-2家族是一類基因結(jié)構(gòu)相似、參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的基因，在各種損傷及瘢痕形成過(guò)程中起非常重要的作用〔5，6〕。Bcl-2家族成員分為兩類，一類是能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，成員有 Bax、Bad、Bid、Bik、Mcl-l和 Al;另一類能抑制細(xì)胞凋亡，包括

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