董文輝 呂玉人 劉永茂 (民航總醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 00025)

環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝過程中前列腺素(PGS)合成的限速酶〔1〕，有 COX-1 和 COX-2 兩種同工酶〔2〕。近年研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞中COX-2表達(dá)。塞來昔布(celecoxib)是第一個高效的COX-2特異性抑制劑〔3〕，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移均有抑制作用。本研究旨在觀察塞來昔布對人宮頸癌Hela細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，并進(jìn)一步探討塞來昔布影響宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所，塞來昔布購自美國輝瑞公司(BK10CCEE069)，四甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，RPMI-1640購自美國Hyclone公司。

1.2 儀器 37℃恒溫空氣搖床(上海醫(yī)療器械廠)，低溫高速離心機(jī)(德國寶麗曼公司)，80I熒光顯微鏡(日本尼康公司)，-80℃冰箱(日本三洋公司)，LD-5臺式離心機(jī)(北京六一儀器廠)，SM-510高壓滅菌鍋(美國YAMATO公司)，電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，pH計(上海精密儀器公司)，磁力攪拌器(上海精密儀器公司)，SW-CJ-1 FD超凈工作臺(深圳市銘科化工有限公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，MCO-175型CO2孵箱(日本三洋公司)，BCD-2398TC冰箱(青島海爾股份有限公司)，75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶斜口、24孔板，Nunclon細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥Nunc公司)。

1.3 方法

1.3.1 塞來昔布配制 取膠囊1粒(含塞來昔布200 mg)，加入20 ml含少量DMSO的生理鹽水充分?jǐn)嚢璩苫鞈乙?，現(xiàn)用現(xiàn)配。0.22 μm濾膜除菌，再用 RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋80倍(320 μmol/L)備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其貼壁生長至70% ～80%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，2～3 d傳代1次。

1.3.3 Hela細(xì)胞塞來昔布體外誘導(dǎo) 將處于指數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用含10%新生牛血清的 IMDM制成5×104個細(xì)胞/L細(xì)胞懸液，每孔100 μl接種于96孔板孔內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，換成含3%新生牛血清的維持培養(yǎng)液100 μl/每孔。接種3塊板(24、48、72 h時間點(diǎn)各1塊)。實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μl終濃度為20、40、80、160 μmol/L 的塞來昔布，每濃度重復(fù)6 孔，同時設(shè)單細(xì)胞懸液不加藥物的正常對照及無細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對照，于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。

1.3.4 細(xì)胞抑制率測定 在每個不同時間點(diǎn)，取對應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行測定。首先于每孔中加入新鮮配制的MTT液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;然后吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入 DMSO 150 μl振蕩至結(jié)晶物充分溶解后，在全自動酶標(biāo)儀上570 nm處檢測吸光度(A)值，計算細(xì)胞生長抑制率。

2 結(jié)果

隨藥物濃度的增加、作用時間的延長塞來昔布對Hela細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，并呈現(xiàn)時間和濃度的依賴性。

當(dāng)濃度為80 μmol/L塞來昔布作用Hela細(xì)胞48 h后，對Hela細(xì)胞的增殖起到明顯的抑制作用，其OD值0.732±1.83，抑制率為30.76%;作用72 h后OD值為0.421±1.89，抑制率為61.90%。因此本文選擇80 μmol/L的塞來昔布作為實(shí)驗(yàn)用量。

表1 塞來昔布對Hela細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的影響(±s)

表1 塞來昔布對Hela細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的影響(±s)

與對照組比較:1)P＜0.01

組別 24 h OD IR(%)48 h OD IR(%)72 h OD IR(%)20 μmol/L 1.125±1.031) 2.933±1.43 0.987±2.21 10.17±1.561) 0.813±2.14 26.43±1.331)1.159±1.89 1.113±2.151 1.105±2.53 40 μmol/L 0.933±1.171) 14.31±1.56 0.868±1.87 19.78±1.691) 0.638±2.23 42.26±2.051)80 μmol/L 0.831±1.881) 28.31±3.37 0.732±1.831) 30.76±2.53 0.421±1.891) 61.90±1.761)160 μmol/L 0.89±1.781) 40.55±2.45 0.565±2.131) 49.24±2.851) 0.355±1.581) 67.87±2.331)對照組

3 討論

文獻(xiàn)報道，在COX-2與宮頸癌的研究中，目前主要的相關(guān)結(jié)論有:①與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中COX-2表達(dá)陽性率增高，腺癌較鱗癌更高 (80.7%和40.6%)，精液可上調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞系COX-2的表達(dá)，并誘導(dǎo)PGE2受體表達(dá)。②宮頸腺癌中COX-2可促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤增殖，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。③宮頸癌COX-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮旁轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。④檢測COX-2在宮頸癌腫瘤組織/間質(zhì)表達(dá)強(qiáng)度之比，可用于預(yù)測放化療的敏感性，比值越高，患者反應(yīng)越差，3 年無病生存率越低〔4，5〕。

COX-2抑制劑發(fā)揮抗癌作用的機(jī)制有:①抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時，對正常細(xì)胞的影響較少。②抑制腫瘤血管生成，降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。COX-2抑制劑可抑制VEGF的合成，降低腫瘤微血管密度，以劑量和時間依賴關(guān)系抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。③增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療和化療的反應(yīng)性。Sorensen等的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的塞來昔布能明顯增強(qiáng)博來霉素、順鉑、長春新堿的細(xì)胞毒作用。④增強(qiáng)腫瘤免疫治療的效果。⑤可逆轉(zhuǎn)腫瘤引起的消瘦和高鈣血癥〔6～10〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示塞來昔布促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用可能大于抑制細(xì)胞增殖的作用，為塞來昔布應(yīng)用于宮頸癌的輔助治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

許多針對宮頸癌的細(xì)胞毒性化療藥物對人體正常組織有毒性作用，致使很多患者難以耐受，因而不能有效抑制宮頸癌的生長。而在本研究中，選擇性COX-2抑制劑能在體外有效抑制宮頸癌細(xì)胞的生長，選擇性越高，抑制作用越強(qiáng)塞來昔布不抑制人胃黏膜前列腺素的產(chǎn)生，消化性潰瘍的發(fā)生率較傳統(tǒng)非甾體抗炎藥降低50%。其對宮頸癌生長的高效抑制和低副反應(yīng)，提示可能成為治療宮頸癌的有效藥物，其臨床療效尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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