吳澤兵 商黔惠 姜黔峰 吳 芹 袁 萍

(遵義醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州 遵義 563003)

高血壓發(fā)病的細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷機(jī)制是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)〔1～3〕;細(xì)胞膜鈉泵(Na+，K+-ATPase)、鈣泵(Ca2+-ATPase)活性減低，是導(dǎo)致高血壓靶器官損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Kent等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠下丘腦、腦干、皮質(zhì)等組織中Na+，K+-ATP酶活性沒變化，但α3亞基表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)，大腦局部缺血激活局部RAS，升高局部 AngⅡ水平〔5〕，血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)拮抗劑厄貝沙坦能有效阻斷AngⅡ的作用，降低血壓，保護(hù)靶器官損害〔2，6，7〕，但有關(guān)厄貝沙坦對腦 ATP 酶的影響鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究厄貝沙坦對二腎一夾(2K1C)腎血管性高血壓大鼠(RHR)腦ATP酶活性及AngⅡ的影響，了解高血壓時ATP酶與AngⅡ之間的相互關(guān)系，探討突然停用降壓藥后血壓反跳的可能機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)高血壓腦損害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 10周齡健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所)，清潔級，體重180～220 g，共40只，合格證號:SCXK(m)2004-16，飼養(yǎng)1 w以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 主要試劑 厄貝沙坦由揚(yáng)子江制藥股份有限公司惠贈;考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、ATP酶測試盒購于南京建成生物工程研究所;AngⅡ試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 主要儀器 BESN-II多通道動物無創(chuàng)測壓儀:南京德塞生物公司;721-16C14型分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;GC-2010γ放射免疫計數(shù)器:科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.4 模型制備〔8〕與分組 戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉大鼠，在左腎動脈放置內(nèi)徑為0.25 mm的銀夾。測量術(shù)前、術(shù)后及用藥后血壓，無創(chuàng)尾動脈測壓儀測定清醒大鼠尾動脈壓，術(shù)后4 w收縮壓≥140 mmHg者確定已形成穩(wěn)定高血壓，即為兩腎一夾RHR制模成功，入選RHR組。在術(shù)后8 w血壓上升穩(wěn)定，將模型制備成功的18只RHR，隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組、停藥組，每組6只，分籠飼養(yǎng)。另設(shè)假手術(shù)組6只，分離左腎動脈，但不安置銀夾。

1.5 給藥方法 術(shù)后第九周開始灌胃，其中厄貝沙坦組給予厄貝沙坦50 mg/kg，1次/d灌胃，連續(xù)8 w。停藥組在給予厄貝沙坦灌胃，7 w后停藥7 d;模型組和假手術(shù)組均以等量蒸餾水灌胃8 w。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血壓的測量 采用BESN-II多通道動物無創(chuàng)測壓儀，在大鼠清醒狀態(tài)下間接檢測尾動脈收縮壓，連續(xù)測量3次，取平均值。

1.6.2 大腦皮質(zhì)和海馬ATP酶活性檢測 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，腹腔注射麻醉，斷頭處死大鼠，摘取大鼠大腦，分離大腦皮質(zhì)和海馬，以上組織用4℃生理鹽水漂洗2～3次后，濾紙吸干水分后稱重，－70℃冰箱保存。從冰箱中取出腦，按W/V 1∶10加入預(yù)冷生理鹽水(4℃)，在勻漿管中恒速勻漿，制成10%組織勻漿，將勻漿液倒入離心管中，4℃ 1 500 r/min離心10 min，取上清液0.2 ml加0.8 ml生理鹽水稀釋成2%的勻漿待測〔9〕。用考馬斯亮藍(lán)法檢測勻漿蛋白的濃度，用酶學(xué)比色法檢測 Na+，K+-ATPase、Ca2+-ATPase活性。

1.6.3 大腦皮質(zhì)和海馬AngⅡ檢測 按照溫紹君法〔10〕組織勻漿，取上清液，用放射免疫法檢測AngⅡ含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。對相關(guān)變量采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對RHR血壓的影響 腎性高血壓大鼠血壓〔(189±15)mmHg〕明顯高于假手術(shù)組〔(134 ±9)mmHg〕(P＜0.01);厄貝沙坦治療8 w后，血壓明顯下降〔(123±7)mmHg〕(P＜0.01);停用厄貝沙坦 7 d，血壓明顯上升〔(154 ±10)mmHg〕(P ＜0.01)。

2.2 厄貝沙坦對RHR腦ATP酶活性的影響 RHR大腦皮質(zhì)和海馬 Na+，K+-ATPase活性顯著降低(P＜0.01，P＜0.05);厄貝沙坦治療后及停藥后，Na+，K+-ATPase活性無明顯改變(P＞0.05)。RHR大腦皮質(zhì)和海馬Ca2+-ATPase活性顯著降低(P＜0.01)，厄貝沙坦治療后Ca2+-ATPase活性明顯升高(P＜0.01)，停藥后Ca2+-ATPase活性顯著降低(均P＜0.01)。見表1、表2。

表1 厄貝沙坦對RHR大腦皮質(zhì)ATP酶活性的影響(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

表1 厄貝沙坦對RHR大腦皮質(zhì)ATP酶活性的影響(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與厄貝沙坦組比較:3)P＜0.01

組別 Na+，K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶4.764±0.502 4.213±0.525模型組 2.780±0.6011) 2.293±0.3611)厄貝沙坦組 3.031±0.7421) 3.768±0.7242)停藥組 2.897±0.6931) 2.228±0.5831)3)假手術(shù)組

表2 厄貝沙坦對RHR大腦海馬ATP酶活性的影響(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

表2 厄貝沙坦對RHR大腦海馬ATP酶活性的影響(±s，n=6，μmolPi·h－1·mgpro－1)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與厄貝沙坦組比較:3)P＜0.01

組別 Na+，K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶8.959±1.854 4.710±0.723模型組 4.632±0.5311) 2.685±0.4961)厄貝沙坦組 5.997±0.9771) 4.409±0.9882)停藥組 5.146±0.8121) 2.789±0.6531)3)假手術(shù)組

2.3 厄貝沙坦對RHR血漿、大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ的影響RHR血漿AngⅡ顯著升高(P＜0.01)，厄貝沙坦治療后及停藥后，AngⅡ進(jìn)一步升高(P＜0.01);RHR大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ顯著升高(P＜0.01，P＜0.05)，厄貝沙坦治療后大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ進(jìn)一步升高;停藥后，大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ顯著降低(P＜0.01)。見表3。

表3 厄貝沙坦對RHR血漿、大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ的影響(±s，n=6)

表3 厄貝沙坦對RHR血漿、大腦皮質(zhì)、海馬AngⅡ的影響(±s，n=6)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較:3)P＜0.01;與厄貝沙坦組比較:4)P＜0.01

組別 血漿(pg/ml) 大腦皮質(zhì)(pg/g) 海馬(pg/g)403.772±96.311 22.387±3.489 66.186±11.890模型組 912.275±137.8892) 58.211±9.4452) 95.008±14.5951)厄貝沙坦組1 288.140±82.1242)3)84.934±22.9422)3) 153.323±39.6202)3)停藥組 1 134.713±172.1732)3)54.217±10.5572)4) 98.878±14.3781)4)假手術(shù)組

2.4 RHR腦ATP酶活性與AngⅡ變化的相關(guān)分析 直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，RHR模型組大腦皮質(zhì)Ca2+-ATPase與大腦皮質(zhì)局部AngⅡ變化呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.900，P＜0.05)，海馬Ca2+-ATPase與海馬局部 AngⅡ變化呈顯著負(fù)相關(guān)(r=－0.831，P ＜0.05)。

3 討論

在中國，高血壓的發(fā)生率高達(dá)18%，腦卒中是高血壓最重要的并發(fā)癥之一，因此，就腦卒中而言，防止其發(fā)生比治療更重要。研究表明，慢性高血壓主要影響各種高血壓動物模型腦內(nèi)小動脈，且不同腦區(qū)改變不同，在額葉皮質(zhì)動脈壁增厚，管腔狹窄;海馬動脈管腔狹窄，管壁面積無改變，表明已發(fā)生重塑。高血壓微血管結(jié)構(gòu)改變和血管網(wǎng)稀疏、消失，可導(dǎo)致灌注不足、大小不等的梗死，引起神經(jīng)元損害。研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，SHR與Wistar-Kyoto(WKY)大鼠比，SHR腦室體積增大2倍，全腦體積和灰質(zhì)、白質(zhì)區(qū)厚度減少，提示SHR存在明顯腦結(jié)構(gòu)和代謝異常。Sabbatini〔12〕等研究發(fā)現(xiàn)，SHR海馬體積減少，神經(jīng)元丟失明顯。提示SHR海馬可能存在神經(jīng)元變性改變。但關(guān)于SHR海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元損害的機(jī)制尚不清楚。

腺苷三磷酸酶在細(xì)胞膜興奮性傳導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等方面發(fā)揮著重要作用，其活性被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞膜功能狀態(tài)的標(biāo)記〔13〕。腦細(xì)胞膜腺苷三磷酸酶活性下降，細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca2+增高，引起細(xì)胞毒性腦水腫和鈣超載;鈣超載可通過干擾線粒體氧化磷酸化使ATP生成減少，導(dǎo)致腺苷三磷酸酶活性進(jìn)一步下降〔14〕，觸發(fā)一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元不可逆性損傷。本研究結(jié)果顯示，RHR腦皮質(zhì)及海馬Na+，K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性下降，局部AngⅡ升高，而且組織Ca2+-ATPase活性與局部AngⅡ呈顯著負(fù)相關(guān)。提示在高血壓時，大腦皮質(zhì)及海馬ATP酶活性降低，RAS系統(tǒng)激活，AngⅡ升高，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，是高血壓腦損害的機(jī)制之一。

研究發(fā)現(xiàn)大腦局部缺血24 h后不僅在缺血側(cè)大腦皮層AT1R mRNA的表達(dá)升高，非缺血側(cè)大腦皮層AT1R mRNA的表達(dá)也升高，提示腦缺血可能激活局部RAS，誘導(dǎo)AT1R的表達(dá)〔15〕。Blezer等〔16〕發(fā)現(xiàn) AT1R拮抗劑氯沙坦能顯著降低自發(fā)性腦卒中高血壓大鼠(SHR-SP)腦卒中的發(fā)生率，延長大鼠的存活時間。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦治療及停藥后，腎性高血壓大鼠大腦皮質(zhì)、海馬Na+，K+-ATPase活性均無明顯改變。但厄貝沙坦治療后Ca2+-ATPase活性顯著恢復(fù)，提示鈣超載緩解，血管痙攣解除，從而延緩腦損害;同時局部AngⅡ水平均明顯升高，提示高血壓時大腦局部缺血，厄貝沙坦通過血腦屏障，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)升高的AT1R特異性結(jié)合，從而阻斷AngⅡ的作用〔17，18〕。另一方面，增加的 AngⅡ與 AT2R 結(jié)合，激活激肽、NO系統(tǒng)，導(dǎo)致血管舒張，減輕靶器官缺血，從而起到腦保護(hù)作用〔16〕。厄貝沙坦停藥后，Ca2+-ATPase活性明顯降低，提示細(xì)胞膜Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱;與此同時，AngⅡ雖然有降低趨勢，但由于受體阻滯作用解除，AngⅡ與AT1R迅速結(jié)合，可能是停藥后大腦局部細(xì)胞調(diào)節(jié)功能紊亂或腦損害的因素之一。

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