彭 坤 王保君 許銀霞 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 45300)

近期研究結(jié)果表明，使用抗青光眼滴眼劑可直接影響抗青光眼濾過手術(shù)的效果，藥物的蓄積作用是濾過手術(shù)失敗的重要影響因子〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)采用組織病理學(xué)和免疫組化方法，觀察單一應(yīng)用噻嗎洛爾及聯(lián)合用藥在不同時(shí)間段結(jié)膜的炎性反應(yīng)情況以及炎性標(biāo)記物在結(jié)膜組織的表達(dá)情況，觀察青光眼滴眼劑炎癥反應(yīng)的發(fā)生時(shí)間，為減少抗青光眼用藥時(shí)間及預(yù)防副作用、增進(jìn)青光眼濾過術(shù)后的效果提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從我科收住的病人中隨機(jī)選擇40歲以上無糖尿病、腎病及風(fēng)濕病史，局部及全身未用過糖皮質(zhì)激素、裂隙燈下檢查球結(jié)膜無微血管瘤、角膜緣無新生血管和眼部無炎癥的原發(fā)性開角型青光眼患者90例，根據(jù)抗青光眼藥物治療的種類分為三組:0.5%噻嗎洛爾與0.2%阿法根聯(lián)合用藥組30例;0.5%噻嗎洛爾單一用藥組30例;無抗青光眼藥物治療即未用藥組30例。單純白內(nèi)障患者作為空白對照組30例。按抗青光眼藥物治療時(shí)間及白內(nèi)障患病時(shí)間分為三個時(shí)相(0～6個月，6～12個月，12～18個月)組，每個時(shí)相組10例。

1.2 方法 (1)標(biāo)本收集:90例球結(jié)膜標(biāo)本均系于小梁切除術(shù)時(shí)，在位于角膜緣鼻上方11～1點(diǎn)部位，以最小的創(chuàng)傷剪除至少2 mm×2 mm球結(jié)膜組織。30例白內(nèi)障患者做晶狀體植入術(shù)時(shí)切除至少2 mm×2 mm球結(jié)膜組織(參與實(shí)驗(yàn)的患者已知情并同意)，每次切除的球結(jié)膜組織立即放于裝有5 ml游離脂肪酸(FAA)固定液的小瓶中，常溫下固定，固定時(shí)間至少24 h，最多不超過半年，所有標(biāo)本常溫下儲藏〔3〕。(2)球結(jié)膜組織病理檢查:球結(jié)膜組織于FAA固定液中取出，放入包埋盒中，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，3 μm厚度切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色。染色結(jié)果在400倍鏡下每例切片隨機(jī)選擇10個不重疊的視野，每張標(biāo)本連續(xù)選擇4張切片，分別計(jì)數(shù)每個視野內(nèi)結(jié)膜上皮組織的細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算其平均值。(3)免疫組織化學(xué)檢查:采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶方法(SABC法)檢測，光鏡下人類白細(xì)胞抗原(HLA)-DR基因型陽性結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色〔4〕。在400倍鏡下每例切片隨機(jī)選擇10個不重疊的視野，每張標(biāo)本連續(xù)選擇4張切片，分別計(jì)數(shù)每個視野HLA-DR1陽性細(xì)胞數(shù)目，計(jì)數(shù)其平均值〔5〕。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)均采用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量測定 空白對照組與未用藥組結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量各時(shí)間點(diǎn)均維持在較低水平上，其差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。單一用藥組與聯(lián)合用藥組在0～6個月，6～12個月結(jié)膜組上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量其差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在12～18個月時(shí)結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高，與前兩個時(shí)間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在0～6個月，6～12個月時(shí)間點(diǎn)上，四組之間結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在12～18個月時(shí)間點(diǎn)上，除空白對照組外，未用藥組與其他組相比其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量(±s，%，n=30)

表1 各組結(jié)膜上皮組織中總細(xì)胞數(shù)量(±s，%，n=30)

與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較:1)P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn)未用藥組比較:2)P＜0.05;與同時(shí)間點(diǎn)單一用藥組比較:3)P＜0.05;下表同

個月聯(lián)合用藥組 27.98±2.02 28.64±1.59 66.15±2.321)2)3)組別 0～6個月 6～12個月 12～18 26.10±1.91 26.75±2.09 27.03±2.12單一用藥組 27.35±2.09 28.15±1.78 50.10±1.861)2)未用藥組 26.40±1.53 27.69±2.10 26.95±1.833)空白對照組

2.2 結(jié)膜上皮組織中HLA-DR免疫組化染色結(jié)果 空白對照組與未用藥組結(jié)膜上皮組織中含HLA-DR抗原的陽性細(xì)胞數(shù)各時(shí)間點(diǎn)均維持在較低水平，其差異不顯著(P＞0.05)。單一用藥組與聯(lián)合用藥組在0～6個月，6～12個月結(jié)膜上皮組織中含HLA-DR抗原的陽性細(xì)胞數(shù)差異不顯著，但是在12～18個月時(shí)結(jié)膜上皮組織中含HLA-DR抗原的陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高，與前兩個時(shí)間點(diǎn)相比差異顯著(P＜0.05)。見表2。

表2 各組結(jié)膜上皮組織中HLA-DR免疫組化染色結(jié)果(±s，%，n=30)

表2 各組結(jié)膜上皮組織中HLA-DR免疫組化染色結(jié)果(±s，%，n=30)

個月聯(lián)合用藥組 6.15±1.56 6.78±1.76 31.24±1.901)2)3)組別 0～6個月 6～12個月 12～18單一用藥組 6.11±1.64 6.29±1.34 21.80±1.881)2)未用藥組 5.75±1.49 5.61±1.08 5.87±1.733)空白對照組5.34±1.47 5.81±1.39 5.66±1.52

3 討論

高眼壓是多數(shù)青光眼主要的危險(xiǎn)因素，降眼壓藥物為首選，也是抗青光眼藥物治療的重點(diǎn)。局部藥物治療是一種傳統(tǒng)的治療方式，但是長期的局部用藥一方面會造成患者依從性較差而影響療效，另一方面患者會出現(xiàn)眼異物感、燒灼感、眼干、流淚等副作用，甚至影響到濾過手術(shù)效果〔6〕。近年來一些研究表明術(shù)前局部滴用抗青光眼藥物可引起結(jié)膜細(xì)胞學(xué)的改變〔7，8〕。Baudouin〔9〕對 124 例原發(fā)性開角型青光眼的觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)膜標(biāo)本中可見上皮內(nèi)的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增加，淺固有層的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞增加，深固有層的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量增加?？梢姡骨喙庋鬯幬飳η蚪Y(jié)膜組織產(chǎn)生明顯的影響，甚至產(chǎn)生亞臨床性炎癥反應(yīng)。

本研究進(jìn)一步證實(shí)原發(fā)性開角型青光眼患者術(shù)前長期滴用一種或多種抗青光眼藥物可以對球結(jié)膜上皮細(xì)胞和球結(jié)膜下組織產(chǎn)生明顯的副作用。這種改變與用藥時(shí)間及用藥方式有關(guān)，局部應(yīng)用抗青光眼藥物1年以內(nèi)者，無論是單一用藥或是聯(lián)合用藥，對球結(jié)膜組織基本上無明顯影響。單一用藥12～18個月的青光眼患者，球結(jié)膜上皮開始出現(xiàn)一些輕度增生或細(xì)胞分離現(xiàn)象，結(jié)膜下細(xì)胞數(shù)量增多，這種改變隨用藥時(shí)間的延長而逐漸加重;聯(lián)合用藥12～18個月的青光眼患者，其球結(jié)膜上皮和結(jié)膜下組織的改變最明顯。此外，本實(shí)驗(yàn)還研究了長期應(yīng)用一種或多種抗青光眼藥物對球結(jié)膜組織炎性標(biāo)記物的影響，用免疫組化技術(shù)檢測HLA-DR的表達(dá)。HLA-DR分子屬于Ⅱ型組織相容性抗原，由位于人類第6號染色體上的HLAⅡ類基因中的DR亞區(qū)所編碼，表達(dá)通常局限于免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞(抗原遞呈細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞，能與外源性的抗原肽結(jié)合，表達(dá)在細(xì)胞表面，即參與外源性抗原遞呈途徑也稱內(nèi)體溶酶體途徑。一些細(xì)胞因子如:γ干擾素(INF-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)能誘導(dǎo)原來不表達(dá)組織相容性復(fù)合體Ⅱ(MHCⅡ)類分子的細(xì)胞表達(dá)該分子。HLA-DR這種炎性標(biāo)記物和炎性反應(yīng)關(guān)系密切，具有炎性標(biāo)記物代表性。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)局部應(yīng)用抗青光眼藥物(單一或聯(lián)合用藥)1年以下，結(jié)膜組織中細(xì)胞陽性表達(dá)較少;而應(yīng)用抗青光眼藥物一年以上者，細(xì)胞陽性表達(dá)增多，尤其是聯(lián)合用藥表達(dá)較多。球結(jié)膜上皮細(xì)胞中炎性標(biāo)記物表達(dá)增加，進(jìn)一步證實(shí)球結(jié)膜組織可能存在炎性反應(yīng)。因此長期用藥1年以上對球結(jié)膜的影響主要表現(xiàn)為球結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度增生，鱗狀化生和上皮表層細(xì)胞分離。球結(jié)膜下成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)量增多以及炎性標(biāo)記物增加。

總之，抗青光眼藥物引起的球結(jié)膜下細(xì)胞數(shù)量增多和亞臨床性炎癥是影響抗青光眼濾過性手術(shù)預(yù)后的重要因素之一，長期用藥引起的結(jié)膜下細(xì)胞增多和亞臨床性炎癥可以導(dǎo)致手術(shù)部位的纖維細(xì)胞過度增生〔10〕，促使傷口過度愈合，從而引起濾過泡和濾過口周圍纖維增生和瘢痕形成，導(dǎo)致濾過性手術(shù)失敗。

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