于 游 張才全 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科,重慶 400016)

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤,無淋巴結轉移的大腸癌5年生存率一般在70% ～80%,而有轉移者僅為 30%〔1〕。淋巴結轉移是影響大腸癌預后的最主要因素之一,也是決定腫瘤分期和制定個體化療方案的主要參考指標。因此,確定大腸癌有無轉移對判斷患者預后及指導治療至關重要。本文70例大腸癌患者的1120枚淋巴結進行常規(guī)病理HE染色和CK20(CK20)及CEA免疫組織化(IHC)檢測,并對兩種方法淋巴結轉移結果進行比較,目的在于探討大腸癌患者淋巴結微轉移對結直腸癌分期的影響,為大腸癌分期和制定個體化療方案作出評價。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2003年10月至2009年10月在我院住院行開腹切除手術的大腸癌患者70例,術前檢查無遠處轉移,術前未進行過化放療。其中男43例,女27例,年齡 32～78歲,平均年齡 55.1歲。部位:升結腸癌15例,橫結腸癌 6例,降結腸癌12例,乙狀結腸癌 12例,直腸上段癌15例,直腸下段10例。病理分型:高分化腺癌23例,中分化腺癌29例,低分化腺癌18例。TNM分期(1978年美國癌癥協(xié)會(AJC)制定的結直腸癌國際 TNM標準):Ⅰ期4例,Ⅱ期29例,Ⅲ期37例。

1.2 試劑 CK20鼠抗人、CEA鼠抗人、即用型抗原修復液及SP試劑盒均購自福州邁新生物制品公司。

1.3 標本 70例結直腸癌標本,共檢獲大腸腸旁、腸壁、腸系膜淋巴結共1 120枚,平均每例(16.5±0.4)枚。每枚新鮮淋巴結標本,統(tǒng)一編號,用甲醛溶液固定,將各蠟塊連續(xù)切片4張,1張行 HE染色,另3張行免疫組化SP法染色。

1.4 實驗方法 石蠟包埋后切片厚度4 μ m,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后,檸檬酸緩沖液微波法修復抗原;3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶的活性;加入抗體,4℃過夜;DAB顯色,顯微鏡下觀察3～10 min,陽性染色為棕色或黃色;蒸餾水沖洗,蘇木素復染,0.1%鹽酸分化,PBS返藍;切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,中性樹膠封固;光鏡下觀察結果。每次染色均以 PBS代替一抗作陰性對照,直腸癌組織作為陽性對照。結果判斷以胞質黃染或棕色為陽性。CK20、CEA定位于細胞質內,陽性細胞呈棕黃色,邊緣處顯著。陰性者無著色,淋巴結中淋巴細胞不著色。淋巴結中發(fā)現(xiàn)CK20、CEA著色細胞,經(jīng)高倍鏡下確認有典型的癌細胞形態(tài),診斷為存在微轉移。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用四格表 χ2檢驗,用 SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1 淋巴結轉移及微轉移檢出率 用HE染色法淋巴結轉移檢出率26.9%(301/1 120),CK20免疫組化淋巴轉移檢測率為36.1%(404/1 120),CEA免疫組化轉移檢測率為34.7%(389/1 120),兩者聯(lián)合檢測率為38.5%(431/1 120)。HE染色法與CK20及CEA免疫組化比較均有顯著性差異(P＜0.05),HE染色法與兩者聯(lián)合檢測率比較有顯著性差異(P＜0.05),CK20與CEA免疫組化檢測率比較無顯著性差異(P＞0.05)。CK20檢測出有微轉移淋巴結103枚,占9.2%(103/1 120),CEA檢測出有微轉移淋巴結88枚,占7.9%(88/1 120)。CK20聯(lián)合CEA檢測出130枚淋巴結檢出有微轉移,占11.6%(130/1 120)。CK20、CEA及二者聯(lián)合檢測三組之間淋巴結微轉移率比較顯著性差異(P＞0.05)。微轉移表現(xiàn)為單個散在或2～3個及數(shù)個聚集小團狀的癌細胞位于淋巴竇內,以邊緣竇為主,見圖 1,圖2。

圖1 CK20陽性淋巴結(SP,×200)

圖2 CEA陽性淋巴結(SP,×200)

2.2 淋巴結微轉移對病理分期的影響 在70例患者檢測出了有24例患者存在微轉移,占34.3%(24/70)。13例 TNM分期提高,其中Ⅰ期Ⅲ期2例,Ⅱ期Ⅲ期11例。HE染色重新分期率為18.6%(13/70)。

2.3 淋巴結微轉移與臨床病理特征關系 微轉移與癌腫浸潤的深度有關,腫瘤浸潤愈深,微轉移愈易發(fā)生(P＜0.05)。微轉移還與組織類型有密切關系,分化程度低者,微轉移陽性率高(P＜0.05)。但微轉移與性別、年齡、腫瘤的部位、大小無關(P ＞0.05),見表1。

表1 結直腸癌淋巴結微轉移與臨床病理特征關系〔n(%)〕

3 討 論

結直腸癌患者,其局部原發(fā)灶采用手術為主的治療方法基本可以控制。但根治術后,其復發(fā)和轉移率高達30%～50%左右,特別是無“淋巴結轉移”的Ⅰ期和Ⅱ期患者,5年內死于局部復發(fā)或轉移的近30%〔2〕。分析其原因可能是因為淋巴結、血道、骨髓中存在的微小轉移灶,用傳統(tǒng)的病理檢查方法很難檢出,而導致臨床無法及時和正確治療〔3〕。傳統(tǒng)上對淋巴結的病理學檢查是通過對其具有代表性的一個切面經(jīng)HE染色作普通光鏡檢查,這種常規(guī)方法不能查累及淋巴結的大部分組織,故有可能忽略淋巴結微轉移的存在。由于這些微轉移有發(fā)展成致命的顯性轉移的可能,因此微轉移的檢測日益為人們所重視。近年來,隨著組織化學和分子生物學技術的發(fā)展,利用免疫組化法可以發(fā)現(xiàn)常規(guī)HE染色所不能發(fā)現(xiàn)的單個癌細胞。Palma等〔4〕運用該方法分析了38例 Dukes B期結直腸癌患者枚淋巴結,檢查發(fā)現(xiàn)7枚淋巴結存在微轉移灶。吳澤宇等〔5〕應用PCR技術對30例胃癌患者共850枚淋巴結檢測微轉移,結果有77枚淋巴結檢出有微轉移,7例患者的腫瘤TNM分期提高,HE染色重新分期率為23.3%(7/30)。但關于淋巴結微轉移檢測對結直腸癌臨床病理分期的影響尚未見文獻報道。本研究中,在70例結直癌病人1 120枚淋巴結中有24例患者共130枚淋巴結檢測出了微轉移,13例患者TNM分期提高,HE染色重新分期達18.6%(13/70)。故免疫組化的檢測可以顯著提高淋巴結轉移的檢出率,有助于更準確地進行結直腸癌的臨床病理分期。為大腸癌合理制定手術方案、指導手術清掃淋巴結及后續(xù)治療提供科學保證,減少結直腸癌術后轉移及復發(fā)、提高結直腸癌以手術為主的綜合治療的療效。

由于腫瘤細胞具有異質性,腫瘤相關基因的表達水平會有很大的差異,單用一種標志物只能檢測出高表達該基因的癌細胞,而對于低水平表達該基因的癌細胞就可能漏檢,所以多標志物聯(lián)合檢測微轉移已成為目前新的研究熱點〔6,7〕,許多學者也在不斷在探索聯(lián)合檢測兩種或兩種以上腫瘤標志物的方法,目前研究比較多的是 CK、CEA、nm23-H(1)、MMP(9)及 TIMP(2)〔8〕。CK系列被認為是檢測循環(huán)癌細胞的敏感標記物。CEA是公認的檢測循環(huán)癌細胞的敏感標記物。筆者認為,多標志物聯(lián)合檢測不僅有助于準確腫瘤分期,可有效避免單一指標造成的遺漏,有助于微轉移的診斷。但在本實驗中CK20、CEA聯(lián)合檢測并未顯著提高微轉移檢測率,并不能否定標志物聯(lián)合檢測微轉移的發(fā)展趨勢,可能與本實驗選擇檢測腫瘤標志物組合不當有關,應摸索更合理的組合,進一步研究。

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3 Doekhie FS,Mesker WE,Kuppen PJ,et al.Detailed examination of lymph nodes improves prognostication in colorectal cancer〔J〕.Int J Cancer,2010;126(11):2644-52.

4 Palma RT,Waisberg J,Bromberg SH,et al.Micrometastasis in regional lymph nodes of extirpated colorectal carcinoma:immunohistochemical study using anti-cytokeratin antibodies AE1/AE3 〔J〕.Colorectal Dis,2003;5(2):164-8.

5 吳澤宇,詹文華,李靖華,等.淋巴結微轉移檢測對胃癌病理分期的影響〔J〕.中華胃腸外科雜志,2006;9(3):217-20.

6 Chen G,Mclver CM,Texler M,et al.Detection of occult metastasis in lymph nodes from colorectal cancer patients:a multiple-marker reverse transcriptase-polymerase chain reaction study〔J〕.Dis Colon Rectum,2004;47(5):679-86.

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