馬 鐸 于 峰 高慧棋 孟 昕 楊志杰 李 勇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院PET-CT室,黑龍江 哈爾濱 150001)

由于肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的前提是腫瘤血管的形成,所以采用抗腫瘤血管生成的基因治療可以取得良好的治療效果。目前,在基因治療方面國外學(xué)者們已取得共識,即盡可能的聯(lián)合多種基因、多種治療手段,以期發(fā)揮更大、更確切的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移效果〔1,2〕。為此,本研究擬采用血管抑素基因聯(lián)合放射性藥物32P-膠體灌注于大鼠肝癌的局部,并觀察其治療效果,分析治療機(jī)制,以期為臨床上廣泛應(yīng)用基因治療提供有力的理論和實踐支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材 總RNA提取試劑盒(Gibco-BRL公司),TUNEL熒光試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),FV500 Olympus激光共聚焦顯微鏡(日本),CT機(jī)為 GE公司的雙排螺旋CT機(jī)。放射性32P-膠體購自北京原子高科有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血管抑素基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Trizol試劑盒提取總RNA。血管抑素基因上游引物為5′-CGAAGCTTGGATCCATGGACCATAAGGAAGTAA-3′,下游引物 5′-TTATGAGCACCGCTTCAGGTTGCAGTAT-3′。按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接入pMD18T克隆載體,構(gòu)建血管抑素的重組質(zhì)粒,測序鑒定正確后擴(kuò)增并提取質(zhì)粒。

1.2.2 肝癌動物模型的制備及分組治療 雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量為140～150 g,購自吉林大學(xué)實驗動物中心。將0.05 ml Walker-256腫瘤細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理研究所提供)接種肝葉,建立肝癌動物模型。7 d后測量腫瘤大小。大鼠分為三組:血管抑素基因治療(治療)組,血管抑素基因 +32P-膠體聯(lián)合治療(聯(lián)合)組,空白對照(對照)組,每組均為20只。大鼠開腹暴露肝臟及其腫瘤,在腫瘤局部分3個位點注射0.2 ml藥液:血管抑素基因質(zhì)粒 (20 μ g)〔3〕及血管抑素基因質(zhì)粒和32P-膠體混合物,對照組于瘤內(nèi)注射等體積的0.9%氯化鈉0.2 ml。

1.2.3 肝癌內(nèi)目的基因mRNA表達(dá) 基因治療肝癌3 d后,每組隨機(jī)選取3只大鼠,分離瘤組織,提取腫瘤總 RNA,采用按cDNA序列設(shè)計合成的引物,按照常規(guī)方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 療效觀察 ①在治療后不同時間測量腫瘤體積(Vt),與治療前腫瘤體積(V0)的比值為腫瘤生長率,用f表示(f=Vt/V0)。比較第7、14、21天各組間腫瘤生長率。②治療21 d后,處死各組大鼠,取腫瘤部位組織,用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,進(jìn)行光鏡檢查。免疫組化測定腫瘤微血管密度(MVD):先在40倍顯微鏡下選擇癌灶內(nèi)微血管最密集的5個區(qū)域,然后在200倍鏡下計數(shù)每個區(qū)域中的血管數(shù),取5個區(qū)域的平均數(shù)作為該只大鼠腫瘤的MVD值;染色為棕色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇、血管腔和紅細(xì)胞不作為判斷微血管的標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。③細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)的測定:采用TUNEL方法。光鏡下觀察,每張切片隨機(jī)選取20個高倍(×400)視野,計數(shù)細(xì)胞,計算凋亡百分率,計算公式:AI=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%〔4,5〕。④腫瘤體積生長率測定:前期實驗發(fā)現(xiàn),開腹采用游標(biāo)卡尺測量時,測量的人為誤差、多次開腹測量后大鼠死亡率增加等原因?qū)Y(jié)果影響很大,并且比較開腹測量與CT測量結(jié)果,發(fā)現(xiàn)兩者沒有明顯差異,所以本研究采用CT測量腫瘤大小。CT掃描條件:120 k V,140 mA,FOV 25,層厚、層距均為3 mm。測量方法:CT掃描測量腫瘤體積VT=1/6π(A×B×C)。A為腫瘤最大層面的前后徑,B為腫瘤最大層面左右徑,C為CT所有層面的上下徑。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件,數(shù)據(jù)資料以±s表示,組間比較采用 χ2檢驗或方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因m RNA的表達(dá) 三者RT-PCR結(jié)果顯示,在治療組和聯(lián)合組的大鼠腫瘤內(nèi),可見到大小為1 400 bp的血管抑素mRNA特異性表達(dá)條帶;而對照組未見到血管抑素mRNA表達(dá)。見圖1。

圖1 肝癌組織內(nèi)血管抑素mRNA的表達(dá)

2.2 三組治療后腫瘤體積的比較 治療組和聯(lián)合組不同時間的腫瘤生長率均小于對照組(P＜0.01)。聯(lián)合組腫瘤生長率最小。見表1。

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

表1 不同組別腫瘤生長率的變化(±s,n=20)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;下表同

組別 7 d 14 d 21 d空白對照組 8.49±1.35 24.65±4.57 44.42±8.79聯(lián)合組 2.68±1.431) 4.89±1.97 1) 6.78 ±2.451)治療組 5.98±1.921) 16.58±2.381) 24.75 ±4.541)

2.3 干預(yù)后各組的MVD、AI結(jié)果比較 經(jīng)過治療后,治療組和聯(lián)合組MVD均低于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);治療組和聯(lián)合組AI均高于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。表明血管抑素基因主要作用于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。聯(lián)合組MVD最低,提示多種具有協(xié)同作用的因素相互作用后抑瘤效果最好。見表2。

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

表2 不同組別治療后MVD和AI的變化(±s,n=20)

組別 MVD AI空白對照組 61.54±11.36 5.46±1.54聯(lián)合組 29.68±3.42 1) 24.85±3.951)治療組 45.93±7.69 1) 15.58±3.481)

3 討 論

肝癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)生和發(fā)展非常復(fù)雜,其根本的原因和致病機(jī)制仍沒有十分清楚,所以傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療等治療手段至今對于肝癌患者,特別是中晚期患者并不能收到滿意的療效。從上世紀(jì)中期人們開始認(rèn)識到腫瘤生長和轉(zhuǎn)移需要腫瘤血管的支持,20世紀(jì)70～90年代已經(jīng)證實腫瘤生長與腫瘤血管生長的關(guān)系密切,并提出“腫瘤血管平衡開關(guān)學(xué)說”。這些理論為血管基因治療腫瘤方案的制訂和完善打下堅實的理論基礎(chǔ)。而許多研究〔2,6〕表明,血管抑制基因的長期應(yīng)用并不引起腫瘤耐藥性,所以抑制腫瘤血管的基因治療研究受到許多學(xué)者的重視。在眾多肝癌基因療法中,抑制腫瘤血管的基因直接作用于腫瘤供血血管,能夠明顯抑制腫瘤血管的生長和轉(zhuǎn)移,從而達(dá)到抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移的效果。本研究的主要意義為明確血管抑素聯(lián)合放射性藥物32P-膠體的抑瘤效果,以便為肝癌的基因治療奠定一個堅實的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究通過腫瘤體積、腫瘤MVD、腫瘤AI等指標(biāo)均可證明局部給予的血管抑素可以達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。這可能與血管抑制基因的產(chǎn)物通過抑制腫瘤新生血管的生長、遷移而達(dá)到治療的作用有關(guān)〔7,8〕。除單一的血管抑素基因治療能夠產(chǎn)生抑制腫瘤血管生長的作用外,本研究還發(fā)現(xiàn):血管抑素和放射性藥物32P-膠體的聯(lián)合應(yīng)用可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),即聯(lián)合基因治療的抑瘤效果明顯好于血管抑素基因單一作用。32P-膠體顆粒直徑1～2 μ m,發(fā)射純 β射線,最大能量1.71 mev,平均能量0.69 mev,最大射程8 mm,組織內(nèi)射程2～4 mm,14.28 d,99%能量累積在瘤內(nèi)注射部位4 mm組織內(nèi)。32P-膠體注入瘤內(nèi)后,由于膠體顆粒大,大部分藥物滯留于肝癌腫瘤組織內(nèi),腫瘤組織內(nèi)受到的損傷大于周圍正常組織,從而降低腫瘤的復(fù)發(fā)。本研究可初步推斷:血管抑素和放射性藥物32P-膠體通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移達(dá)到抑瘤的目的,具有很好的抗肝癌療效。

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