邵 川 魯沈源 勵雯靜 隆 玄 李善群 白春學 (復旦大學附屬中山醫(yī)院呼吸科,上海 200032)

腎臟是一個高血流量高灌注的臟器,對氧供給和氧張力的變化較敏感,因此很容易受到缺氧性損傷〔1〕,成為阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)容易累及的靶器官之一。目前對OSAHS引起腎臟損害的具體機制尚未完全闡明,相關基礎研究匱乏。慢性間歇低氧(CIH)是OSAHS的重要病理生理過程之一,是引起全身和局部氧化應激、炎癥反應的重要環(huán)節(jié)。本研究通過觀察CIH大鼠腎臟組織細胞形態(tài)和超微結構的變化初步探討OSAHS對腎臟的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。動物艙、氣體控制通路裝置、氧濃度測量儀(靈敏度0.1%)由上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠特約制作。醫(yī)用壓縮氧氣 (濃度 ＞99.5%)、壓縮氮氣 (高純氮,濃度 ＞99.999%)、壓縮空氣由上海五鋼氣體有限責任公司充裝。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 清潔級雄性SD大鼠18只,體重140～150 g,鼠齡4周齡,隨機分對照組和CIH組,每組8只。

1.2.2 CIH動物模型的建立 將CIH組置于低氧動物艙,在氧濃度測量儀的監(jiān)測下,通過控制程序調(diào)節(jié)氧氣、氮氣的輸入流量從而調(diào)控箱內(nèi)氧濃度,氧氣、氮氣的輸入時間和順序如下:輸入純氮氣 30 s(FiO2降至7%左右)-靜息10 s-輸入純氧氣20 s(FiO2升至21%左右),每分鐘為一個缺氧循環(huán),低氧動物艙內(nèi)的氧氣濃度呈周期性波動。艙內(nèi)CO2與水蒸氣用適量鈉石灰吸收。每天8 h,持續(xù)35 d。對照組艙內(nèi)輸入空氣,其余條件同CIH組。

1.2.3 標本采集 16.7%烏來糖(氨基甲酸乙酯)溶液0.15 ml/10 g體重腹腔注射麻醉,迅速切下左腎小塊腎皮質(zhì),在預冷的電鏡固定液中將其切成3～4塊1 mm×1 mm×1 mm的小塊置入電鏡固定液4℃保存。生理鹽水150 ml(室溫)、4%多聚甲醛(4℃)500 ml灌流固定后取右腎放入中性甲醛4℃保存。

1.2.4 HE染色 組織塊常規(guī)石蠟包埋,4 μ m切片,切片常規(guī)用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級乙醇至水洗。蘇木素染色5 min,自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30 s(提插數(shù)下)。自來水浸泡15 min。置伊紅液2 min。常規(guī)脫水,透明,封片。普通光鏡下觀察。

1.2.5 透射電鏡檢查 標本按常規(guī)方法處理后,做成80 nm超薄切片,用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色法染色,在Pilipps CM120透射電鏡下觀察腎近曲小管上皮細胞超微結構。病變按嚴重程度分為4級:無病變(-)、輕度病變(+)、中度病變()、中度病變()。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0軟件包進行確切概率統(tǒng)計法。

2 結 果

2.1 組織細胞形態(tài) 對照組腎小球、近曲小管和遠曲小管未見明顯異常。CIH組8例均表現(xiàn)為腎小球高度腫脹,腎球囊狹窄,球囊間隙消失(P=0.000);腎小管上皮細胞高度腫脹變性,管腔狹窄以至消失(P=0.000),遠曲小管未見明顯異常,如圖1。

圖1 兩組大鼠腎臟HE染色組織病理圖(×400)

圖2 兩組大鼠腎近曲小管上皮細胞透射電鏡圖(×8 400)

2.2 超微結構 對照組腎近曲小管上皮細胞超微結構無異常表現(xiàn)。CIH組近曲小管上皮細胞超微結構均出現(xiàn)不同程度的空泡變性、核膜腫脹和線粒體腫脹,其中空泡變性均為重度(P=0.000);核膜腫脹7例為中度,2例為重度(P=0.001);線粒體腫脹7例為輕度,2例為中度(P=0.000)。如表1、圖2。

表1 兩組大鼠腎近曲小管上皮細胞超微結構(n,n=8)

3 討 論

OSAHS以反復上氣道阻塞從而導致間歇性呼吸暫停和低通氣為特點。臨床表現(xiàn)包括打鼾、睡眠結構紊亂、注意力和記憶力下降、情緒低落和日間嗜睡等〔2〕。近些年的研究發(fā)現(xiàn) OSAHS亦可引起血肌酐升高和尿蛋白增加〔3～5〕,此外 OSAHS也可能對腎臟的內(nèi)分泌功能產(chǎn)生影響。OSAHS對腎臟影響的具體機制尚未闡明,CIH是OSAHS的重要病理生理過程之一,是導致OSAHS患者體內(nèi)氧化應激失衡和炎癥反應的重要環(huán)節(jié),推測CIH可能是OSAHS患者腎臟損害的原因之一,因此我們通過CIH動物模型,初步探討CIH對腎臟的影響,借此進一步理解OSAHS腎臟損害的致病機制。

我們的研究發(fā)現(xiàn)腎臟組織形態(tài)在CIH的影響下已出現(xiàn)顯著的可逆性損傷,腎小球腫脹和腎球囊狹窄可能對腎小球濾過功能產(chǎn)生影響,腎小管上皮細胞腫脹和管腔狹窄也可能影響到腎小管的重吸收和分泌功能。我們推測隨著CIH時間的延長,腎臟形態(tài)學損傷將進一步加重甚至出現(xiàn)組織細胞凋亡、壞死、間質(zhì)增生、纖維化等反應。透射電鏡檢查發(fā)現(xiàn)CIH大鼠腎近曲小管上皮細胞出現(xiàn)大量空泡變性、核膜腫脹和線粒體腫脹?？张菔菙U張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹到一定程度可變成囊泡狀,即鏡下觀察到的空泡變性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞質(zhì)中由相互連通的管道、扁平囊和潴泡所組成的膜系統(tǒng),主要功能是參加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成、加工、包裝和運輸,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹和功能障礙將影響蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成和分泌,從而廣泛影響細胞功能。核膜是位于真核生物的核與細胞質(zhì)交界處的雙層結構膜,它作為細胞質(zhì)同細胞核之間的界膜,對穩(wěn)定核的形態(tài)和化學成分起著十分重要的作用。核膜的主要功能包括屏障作用、控制細胞核與細胞質(zhì)之間的信息和物質(zhì)交換、協(xié)助染色質(zhì)(體)定位和細胞分裂以及某些生物合成的功能等。核膜腫脹將對核膜的多種功能產(chǎn)生影響甚至關系到細胞存亡。線粒體是具有雙層膜結構的細胞器,外膜平滑,內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴,兩層膜之間有腔。線粒體主要功能是將有機物氧化產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化為ATP,是細胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要場所。線粒體在細胞缺氧中毒時可變空,嵴減少或消失,體積增大,甚至破裂,即線粒體腫脹。線粒體腫脹將直接導致細胞能量代謝障礙,這可能是CIH大鼠腎近曲小管上皮細胞高度水腫的原因之一。

總之,我們的研究發(fā)現(xiàn)CIH對腎臟超微結構、組織形態(tài)有顯著影響。本研究的不足之處是未同時設立持續(xù)低氧組和復氧干預組。持續(xù)低氧與CIH所引起的病理生理過程不同,通過比較可進一步探討CIH導致腎臟損害的特點,設立復氧干預組不但可以再次驗證實驗結果,還能探討CIH腎損傷的防治機制,為持續(xù)氣道正壓(CPAP)治療OSAHS相關的腎損傷提供理論依據(jù),這些有待于我們今后進一步研究。

1 Nangaku M,Eckardt KU.Hypoxia and the HIF system in kidney disease〔J〕.J Mol Med,2007;85(12):1325-30.

2 Lieberman JA 3rd.Obstructive sleep apnea(OSA)and excessive sleepiness associated with OSA:recognition in the primary care setting 〔J〕.Postgrad Med,2009;121(4):33-41.

3 Büchner NJ,Henning BF,H?gele KF,et al.Renal function in hypertensive patients with obstructive sleep apnea〔J〕.Dtsch Med Wochenschr,2004;129(7):305-9.

4 Michael DF,Amy Storfer Isser,H Lester Kirchner,et al.Obstructive sleep apnea is associated with increased urinary albumin excretion 〔J〕.Sleep,2007;30(7):923-9.

5 Ahmet Ursavas,Mehmet Karadag,Mustafa Gullulu,et al.Low-grade urinary albumin excretion in normotensive/non-diabetic obstructive sleep apnea patients〔J〕.Sleep Breath,2008;12(2):217-22.