陳 敏 勞 明 韋獻良 劉承偉 (桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,廣西 桂林 54004)

帕金森病(PD)是一種常見的主要影響老年人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其癥狀主要為軀體隨意運動障礙,表現(xiàn)為震顫、肌肉僵硬和運動障礙等軀體運動和肌張力改變。脊髓前角運動細(xì)胞作為軀干四肢運動傳導(dǎo)通路的下運動神經(jīng)元,是支配軀體隨意運動的重要組成部分。本實驗采用MPTP誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠制備PD模型,試圖說明PD中脊髓前角是否出現(xiàn)病理改變以及出現(xiàn)怎樣的改變,并通過不同年齡小鼠的分組探索年齡因素與病理改變的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性C57BL/6J小鼠,SPF級,8周齡16只,18月齡18只,體重20～25 g,由南京大學(xué)模式動物研究所提供,飼以我校實驗動物中心提供的飼料(成分為大米粉、玉米粉、魚粉等)。自由攝食、飲水,適應(yīng)喂養(yǎng)1 w。實驗室溫度25℃～28℃,通風(fēng)、自然采光。

1.2 主要試劑 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)。

1.3 動物分組及建立模型 將8周齡和18月齡各隨機分成模型組和對照組,即8周齡模型組,8周齡對照組,18月齡模型組,18月齡對照組,各組均為8只。(18月齡模型組原有10只,在建模過程中死亡2只而退出實驗。)模型組:每日上午10點腹腔注射MPTP(30 mg/kg體重),每日一次,連續(xù)五日;對照組:與模型組同天腹腔注射同體積的生理鹽水,連續(xù)五日。

1.4 電鏡標(biāo)本制作方法 1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉,快速開胸,經(jīng)左心室插管至升主動脈,快速灌注生理鹽水(p H=7.4),緩慢4%多聚甲醛-2.5%戊二醛灌注。從椎管中取出脊髓,切取頸膨大和腰骶膨大,切成1 mm3小塊,按電鏡常規(guī)做成超薄切片,醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察 模型組在注射MPTP 5～10 min內(nèi)顯得躁動不安,在籠內(nèi)來回奔跑、爬高,出現(xiàn)立毛、細(xì)小震顫,以下頜呈點頭狀震顫常見。10 min后開始運動減少,蜷縮成團,籠內(nèi)幾只老鼠多聚臥在一起,此時立毛、豎尾、弓背明顯,誘導(dǎo)其活動時步態(tài)不穩(wěn),以后肢明顯,時見拖曳前行。皮毛散亂,失去光澤。目光呆滯,對外界刺激反應(yīng)降低或根本無反應(yīng)。3 h后以上急性中毒反應(yīng)減弱,12 h后基本消失,但運動仍減少。

2.2 脊髓前角超微結(jié)構(gòu)改變 神經(jīng)元水樣變性,線粒體腫脹,嵴間隙變寬,嵴消失,基質(zhì)濃度降低和部分空泡化;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、脫顆粒;溶酶體增多,內(nèi)有吞噬小泡,尤以18月齡模型組明顯。凋亡神經(jīng)元較多,細(xì)胞皺縮,核染色質(zhì)濃縮、邊集,胞漿濃縮,電子密度增加。脹亡神經(jīng)元胞體明顯腫脹,核染色質(zhì)分散,邊集,胞膜斷裂,胞質(zhì)出現(xiàn)蟲蝕狀和空泡化,細(xì)胞器減少,線粒體腫脹,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張(圖1)。神經(jīng)元軸突樹突腫脹透亮,微絲、微管失去正常整齊排列,呈斷裂、卷曲狀,髓鞘褪變,板層斷裂、分離。星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大,常成群分布,細(xì)胞胞體、胞核增大,胞漿豐富,其內(nèi)細(xì)胞器也增多。小膠質(zhì)細(xì)胞增多不明顯,胞體增大,突起變短增粗或消失,胞質(zhì)內(nèi)溶酶體豐富。廣泛出現(xiàn)血腦屏障(BBB)通透性增加的改變。對照組未發(fā)現(xiàn)有病理改變。

圖1 脊髓前角超微結(jié)構(gòu)改變(×10 000)

3 討 論

3.1 MPTP的制模機制和PD模型成功的指標(biāo) MPTP為強脂溶性化合物,極易透過血腦屏障,但在大腦和小腦中分布較少。MPTP本身沒有毒性,可以選擇性地濃集于黑質(zhì)周圍,被膠質(zhì)細(xì)胞攝取后,在線粒體內(nèi)由單氨氧化酶B(MAO-B)使之轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),MPP+的結(jié)構(gòu)和 DA比較類似,被黑質(zhì)神經(jīng)元末梢攝取后,通過抑制線粒體的呼吸功能,產(chǎn)生氧自由基和Ca2+內(nèi)流的改變等作用使黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞壞死、凋亡,產(chǎn)生類似于PD的癥狀和病理改變〔1〕。因此,MPTP是制作PD模型的 理想藥 物〔2〕。 C57BL/6J小鼠對 MPTP 較 為敏 感〔3〕,MPTP誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠PD模型10多年來已在各國實驗室廣泛采用。

在本實驗中,我們以中等劑量〔4〕(30 mg/kg體重,連續(xù)5 d)的MPTP腹腔注射誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠PD模型,小鼠打藥后出現(xiàn)急性中毒反應(yīng),表現(xiàn)出典型的PD行為學(xué)改變,電鏡觀察到包括黑質(zhì)致密區(qū)在內(nèi)的中腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元的嚴(yán)重缺失(資料待發(fā)表),本實驗結(jié)果顯示在脊髓前角出現(xiàn)神經(jīng)元的缺失和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生等與黑質(zhì)的改變類似,因此,我們認(rèn)為所建模型是成功的。

3.2 年齡因素與病理改變的相關(guān)性 年齡老化導(dǎo)致多巴胺遞質(zhì)逐年減少,但老年人患病者僅為少數(shù),且好發(fā)年齡通常在51～60歲之間,按年齡推斷,如果老化是惟一病因的話,此時多巴胺水平尚未達到足夠低的程度,說明生理性多巴胺能神經(jīng)元退變不足以引起本病,只有黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元減少50%以上,紋狀體多巴胺遞質(zhì)減少80%以上,才會出現(xiàn)PD的臨床運動癥狀,而正常神經(jīng)系統(tǒng)老化并不會達到這一水平。此外,正常老化發(fā)生的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元脫失的形式與PD不同,前者的神經(jīng)元脫失位于黑質(zhì)背層,而后者的神經(jīng)元脫失絕大部分位于腹外側(cè)層,絕少部分位于背層。因此,年齡老化只是PD的促發(fā)因素之一。

實驗選取了8周齡和18月齡的兩個年齡段小鼠作為實驗對象進行分組研究,考察年齡因素與病理改變的相關(guān)性。實驗過程中,在相同的劑量和條件下,均是18月齡組小鼠出現(xiàn)死亡情況,我們考慮是由于老齡小鼠對藥物毒性作用的耐受力較弱,且本實驗數(shù)據(jù)結(jié)果分析中老齡模型組的病理改變較成年模型組更為顯著,提示年齡老化確實是PD發(fā)生不可忽視的原因。隨著年齡增加,谷胱甘肽過氧化酶及過氧化氫酶減低,單胺氧化酶增加,鐵、銅、鈣聚集,黑色素聚集,且黑質(zhì)、紋狀體多巴胺神經(jīng)元發(fā)生退行性變,色素顆粒及神經(jīng)細(xì)胞脫失,均為正常神經(jīng)系統(tǒng)老化的改變,但同時又是PD病理變化的基礎(chǔ)。因此,我們認(rèn)為,用老齡小鼠制備PD模型更能模擬PD真實的發(fā)病條件,是更為適當(dāng)?shù)倪x擇。

3.3 PD中的脊髓前角改變 PD是臨床一大頑癥,雖經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者多年的潛心研究,但是其發(fā)病機制尚不完全清楚。目前一般研究認(rèn)為PD的發(fā)生與紋狀體-黑質(zhì)-紋狀體錐體外路系環(huán)路功能障礙有關(guān)。在此環(huán)路中,中腦黑質(zhì)對骨骼肌運動的調(diào)節(jié)起著重要作用。黑質(zhì)的致密部多巴胺能神經(jīng)元合成釋放DA,并投射到新紋狀體,通過黑質(zhì)紋體纖維儲存于新紋狀體內(nèi),有抑制蒼白球活動作用。所以當(dāng)黑質(zhì)受損時,使新紋狀體的多巴胺含量減少80% ～99%,因而來自紋狀體-黑質(zhì)-蒼白球?qū)顾枨敖沁\動神經(jīng)元的抑制大大減弱甚或消失,脊髓前角運動神經(jīng)元功能被釋放,則出現(xiàn)肌張力增強,運動減少,同時伴有肌震顫〔5〕的發(fā)生。按照此學(xué)說,脊髓前角細(xì)胞應(yīng)該沒有受到損傷,只是功能發(fā)生了改變。但是,在本實驗中,我們通過透射電鏡觀察到在PD中脊髓前角細(xì)胞發(fā)生了器質(zhì)性病理改變,包括神經(jīng)元大量的變性、脹亡及凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。脊髓前角神經(jīng)元大部分為軀體運動神經(jīng)元,支配軀干和四肢的運動。因此,我們認(rèn)為,脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量的急劇下降以及變性神經(jīng)元的廣泛出現(xiàn)是導(dǎo)致PD模型組動物運動減少的原因之一。

PD的特征性病理變化之一為膠質(zhì)細(xì)胞增生,主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。在本實驗中觀察到脊髓前角星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛肥大增生,我們認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞增多的原因如下:MPTP必須被星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取,才能轉(zhuǎn)化成為MPP+,因此,神經(jīng)元的損傷根源之一于星形膠質(zhì)細(xì)胞的物質(zhì)代謝。迅速增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷部位形成一個相對較封閉的環(huán)境,阻止炎癥向其他區(qū)域擴散〔6〕。星形膠質(zhì)細(xì)胞在 PD病變的整個過程中,其數(shù)量、形態(tài)以及功能都發(fā)生了變化,產(chǎn)生了種類多、數(shù)量大的各種細(xì)胞因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子,這些因子相互促進,相互制約,既參與了PD的發(fā)病,更在神經(jīng)的再生修復(fù)過程中發(fā)揮著不可忽視的作用。我們認(rèn)為,星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的保護和修復(fù)功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它對神經(jīng)元的損傷,有著廣泛的研究和治療前景。

本實驗發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的增生不明顯,但是可見到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞。對于這個結(jié)果,我們考慮是由于小膠質(zhì)細(xì)胞活化先于神經(jīng)元變性。有研究表明:小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)于注射MPTP 12 h后開始,12～48 h高峰,7 d后無明顯變化,而酪氨酸羥化酶免疫組化陽性細(xì)胞于72 h后開始減少。本實驗中在MPTP注射5 d取材,此時小膠質(zhì)細(xì)胞增生的高峰期已過,因此小膠質(zhì)細(xì)胞的增生不明顯。但是,我們觀察到的小膠質(zhì)細(xì)胞體積大,無突起,有吞噬物,提示此時的小膠質(zhì)細(xì)胞為活化型?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞通過釋放大量的炎性因子產(chǎn)生炎性反應(yīng)對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。也有學(xué)者認(rèn)為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子〔7〕。但是許多研究證實,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的致病作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它的神經(jīng)保護作用,如 He等〔8〕于應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素(美滿霉素)可以抑制PD模型黑質(zhì)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞的增生,同時可以保護多巴胺能神經(jīng)元。

關(guān)于脊髓前角產(chǎn)生病理改變的原因,我們考慮有如下可能性:第一,黑質(zhì)受損累及脊髓。①MPTP在黑質(zhì)轉(zhuǎn)化成MPP+后,通過紋狀體-黑質(zhì)-紋狀體錐體外路系環(huán)路的物質(zhì)運輸和交換到達脊髓前角,再被脊髓前角神經(jīng)元的樹突主動攝取,通過抑制線粒體的呼吸鏈導(dǎo)致神經(jīng)元損害。②黑質(zhì)病變產(chǎn)生了各種炎性因子、氧自由基等有害物質(zhì)通過體內(nèi)循環(huán)的各種途徑到達脊髓,引起脊髓前角細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)導(dǎo)致病變。第二,脊髓直接受到損害。MPTP直接被脊髓前角的星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取,產(chǎn)生MPP+,被脊髓前角神經(jīng)元攝取而損傷。我們認(rèn)為脊髓前角細(xì)胞的病理性變化是PD運動障礙的原因和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一,PD的病變部位更加廣泛,并不局限于黑質(zhì)和紋狀體,而是涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部分,甚至是全身性疾病。

但是,在實驗中我們是以MPTP制作PD模型來顯示PD的發(fā)病過程和癥狀,而PD患者的發(fā)病并不是由于MPTP的作用,所以,也有可能是MPTP對脊髓有損害,而PD患者就不一定存在該損害。因此,對于脊髓前角的病變還有待進一步研究。

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