陸亞鵬 劉思園 朱 俐 (南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所,江蘇 南通 22600)

阿爾茨海默病(AD)是一種病因未明的神經(jīng)退行性疾病,Aβ在腦組織中的異常增加和沉積是AD主要的病理改變。Aβ通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種神經(jīng)毒性,引起海馬和皮層等處膽堿能神經(jīng)元的退變,可能是導(dǎo)致AD患者記憶和認(rèn)知障礙的主要原因〔1〕。蝦青素(AST)屬于類胡蘿卜素,具有較為突出的抗氧化和抗炎活性〔2〕,能夠穿透血腦屏障〔3〕。為了考察蝦青素在 AD治療中的應(yīng)用潛力,本研究首次以 Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元損傷為模型研究蝦青素對Aβ的神經(jīng)毒性的抑制作用,并為深入研究蝦青素的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱(5400,NAPCO公司),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Elx800,BiO-TEK公司),正置熒光顯微鏡(DM4000B,Leica公司)、倒置熒光顯微鏡(DMIRB,Leica公司)。Neurobasal Medium/B27、DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen公司),胰蛋白酶 (Cell Signaling Technology 公司),Aβ25～35、AST、多聚賴氨酸、Hoechst 33342、DCFH-DA、MTT、羅丹明123(Sigma公司),DMSO(Amresco公司)。其他試劑均為分析純。

1.2 小鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng) 取胎齡為13～15 d的ICR小鼠,無菌條件下分離出大腦皮層,在 D-Hank′s平衡鹽溶液中漂洗3遍,徹底剔除腦膜和表面血管,剪碎后用終濃度為0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min,用含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml,接種于預(yù)先鋪有L-多聚賴氨酸的96孔或24孔培養(yǎng)板中,96孔培養(yǎng)板每孔100 μ l,24 孔培養(yǎng)板每孔 1 000 μ l。 置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,用Neurobasal Medium/B27全部換液,培養(yǎng)3 d后加入鹽酸阿糖胞苷(終濃度為10-5mol/L)作用24 h抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長,以后每隔2～3 d換液1次,培養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)免疫熒光標(biāo)記,隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)相鄰細(xì)胞,證實(shí)神經(jīng)元純度達(dá)90%以上。

1.3 Aβ25～35的孵育 將 Aβ25～35溶于滅菌蒸餾水中,配成濃度250 μ mol/L的母液分裝,于-20℃凍存。使用前置入37℃下孵育7d,使其老化、聚集。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 正常組:不加任何處理因素;模型組:取5、10、15、20 μ mol/L 4 個(gè)濃度的 Aβ25～35處理細(xì)胞 24 h,選擇合適造模濃度;AST 保護(hù)組:分 別用 250、500、1 000、2 000、4 000 nmol/L濃度的AST預(yù)處理2 h后加入 Aβ25～35共同孵育24 h。

1.5 MTT法測定神經(jīng)元活力 將細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板,培養(yǎng)神經(jīng)元按實(shí)驗(yàn)要求處理后,向96孔板中加入每孔180 μ l Neurobasal無血清培養(yǎng)基和 5 g/L 的 MTT 20 μ l,孵育 4 h后,吸棄上清液,每孔加150 μ l DMSO振蕩10 min,用自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀,在570 nm波長處測各孔的吸光度(OD)值。相對細(xì)胞活力(%)=處理組的OD值/對照組的OD值 ×100%。

1.6 ROS檢測 接種于96孔板中的神經(jīng)元經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后,用含10 μ mol/L DCFH-DA熒光探針的培養(yǎng)液于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次以去除探針。用自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀檢測DCF,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm。DCF相對熒光強(qiáng)度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值 ×100%。

1.7 Hoechst 33342熒光染色檢測細(xì)胞凋亡 將生長于24孔培養(yǎng)板內(nèi)蓋玻片上的神經(jīng)元,經(jīng)過不同處理后用0.01 mol/L PBS洗兩遍,加4%多聚甲醛室溫下固定1 h,用0.01 mol/L PBS洗3遍后加入5 mg/L Hoechst工作液,4℃避光孵育1 h,用0.01 mol/L PBS洗3遍后將蓋玻片附有細(xì)胞的一面倒扣在滴加10 μ l緩沖甘油的載玻片上。通過正置熒光顯微鏡觀察,正常細(xì)胞核呈彌散均勻的熒光,凋亡的細(xì)胞核呈團(tuán)狀或碎塊狀致密濃染的強(qiáng)熒光。計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率(%)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.8 線粒體膜電位的測定 線粒體膜電位測定按照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法〔4〕,有少許改動(dòng)。接種于96孔板中的神經(jīng)元按實(shí)驗(yàn)要求處理后,加入含1 g/L Rhodarmine123的培養(yǎng)液于37℃孵育15 min,0.01 mol/L PBS洗滌3次,用自動(dòng)酶標(biāo)檢測儀506 nm激發(fā)波長,529 nm發(fā)射波長檢測Rhodarmine123熒光強(qiáng)度。Rhodarmine123相對熒光強(qiáng)度(%)=處理組的熒光值/對照組的熒光值 ×100%。樣品在倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照。

2 結(jié) 果

2.1 MTT測定結(jié)果 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AST濃度大于4 000 nmol/L時(shí)神經(jīng)元活力出現(xiàn)下降現(xiàn)象,在250～4 000 nmol/L范圍內(nèi)神經(jīng)元活力無明顯變化,表明該濃度范圍對神經(jīng)元無明顯毒性,因此選擇250～4 000 nmol/L作為本研究AST的處理濃度范圍。經(jīng)老化處理的Aβ25～35可以劑量依賴性的引起細(xì)胞活力下降。 用 5、10、15 和 20 μ mol/L Aβ25～35作用于神經(jīng)元24 h后,相對細(xì)胞活力分別為63.9%±7.4%、46.4%±4.5%、35.2% ±5.4%和18.3%±3.0%,因此本實(shí)驗(yàn)選用10 μ mol/L Aβ25～35來制備神經(jīng)元損傷模型。MTT測定結(jié)果如表 1所示,500～4 000 nmol/L的 AST可明顯拮抗10 μ mol/L Aβ25～35引起的細(xì)胞活力下降,其中 2 000 nmol/L 的AST作用效果最為顯著(P＜0.01)。

2.2 ROS水平檢測結(jié)果 神經(jīng)元內(nèi)ROS水平檢測結(jié)果見表1。皮層神經(jīng)元經(jīng)10 μ mol/L Aβ25～35處理24 h后細(xì)胞內(nèi) ROS明顯增加,500～4 000 nmol/L AST預(yù)處理能有效防止Aβ25～35誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS積累,與模型組相比,有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 凋亡檢測結(jié)果 Hoechst 33342檢測結(jié)果如圖1、表 2所示。正常組神經(jīng)元細(xì)胞核呈彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光,而Aβ25～35模型組一些細(xì)胞核呈濃染致密的固縮形態(tài)和顆粒狀熒光,為凋亡的典型形態(tài)。2 000 nmol/L AST處理組,固縮形態(tài)和顆粒狀熒光的細(xì)胞核顯著減少(P＜0.01)。

2.4 線粒體膜電位 線粒體膜電位的檢測結(jié)果如圖2、表2所示。10 μ mol/L Aβ25～35處理皮層神經(jīng)元24 h導(dǎo)致線粒體膜電位明顯下降,表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)聚集的Rhodarmine 123明顯減少。膜電位下降是線粒體受損的重要表現(xiàn),而用2 000 nmol/L AST預(yù)處理對神經(jīng)元的線粒體功能有明顯的保護(hù)作用,Rhodarmine 123的熒光值明顯高于模型組 (P＜0.01)。

表1 AST對Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元活力下降和胞內(nèi)ROS水平上升的影響(±s,n=8)

表1 AST對Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元活力下降和胞內(nèi)ROS水平上升的影響(±s,n=8)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與A β25～35模型組比較:2)P ＜0.05,3)P＜0.01

組別 相對細(xì)胞活力(%) DCF相對熒光強(qiáng)度(%)空白對照組 100.0±3.1 100.0±4.5 Aβ25～35模型組 48.9 ±3.51) 251.8 ±10.31)AST保護(hù)組250 nmol/L 52.8 ±6.0 233.4±13.4 500 nmol/L 60.9±5.12) 174.5 ±12.73)1 000 nmol/L 81.9 ±2.23) 130.0 ±8.03)2 000 nmol/L 91.3±4.73) 125.1 ±13.23)4 000 nmol/L 88.6 ±6.93) 144.7 ±9.73)

圖1 AST對 Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡的影響(bar=20 μ m)

圖2 AST對 Aβ25～3 5誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元線粒體膜電位損傷的影響(bar=50 μ m)

表2 AST對Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡和線粒體膜電位損傷的影響(±s,n=6)

表2 AST對Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元凋亡和線粒體膜電位損傷的影響(±s,n=6)

與空白對照組比較:1)P＜0.01;與 Aβ25～35模型比較:2)P ＜0.01

組別 凋亡率(%) Rhodarmine 123相對熒光強(qiáng)度(%)空白對照組 5.2±1.1 100.0±3.0 Aβ25 ～35模型組 43.9 ±3.51) 51.8 ±6.91)AST保護(hù)組 18.3±4.92) 84.1±7.22)

3 討 論

AST具有多種藥理活性,在糖尿病、腫瘤和心腦血管疾病的防治方面有很大的臨床應(yīng)用潛力〔5〕。作為類胡蘿卜素中唯一被證實(shí)能穿透血腦屏障的成員,AST可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其是對大腦起到保護(hù)作用〔6〕。

腦部Aβ的沉積是AD的典型病理特征之一。Aβ由39～43個(gè)氨基酸殘基組成,Aβ25～35是其主要的毒性片段,對體外培養(yǎng)及在體的神經(jīng)細(xì)胞均有毒性作用〔7〕。膽堿能神經(jīng)元退行性病變與 AD密切相關(guān),本研究利用 Aβ25～35誘導(dǎo)小鼠皮層神經(jīng)元損傷作為AD的細(xì)胞模型,能很好地模擬AD的病理特征。

本結(jié)果可以說明AST具有保護(hù)線粒體膜和酶的功能,能夠維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),使神經(jīng)元死亡率明顯降低。Aβ可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS而造成氧化應(yīng)激損傷。線粒體不僅是細(xì)胞中ROS的主要產(chǎn)生場所,也是對氧化損傷非常敏感的細(xì)胞器〔8〕。超過正常水平的ROS會(huì)影響線粒體膜的性質(zhì)和功能,損傷線粒體呼吸鏈及其相關(guān)代謝酶,導(dǎo)致線粒體膜電位下降、能量代謝受阻、線粒體腫脹、并可釋放細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子,介導(dǎo)細(xì)胞死亡〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)AST預(yù)處理可有效抑制胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,2 000 nmol/L的AST抑制效果最為明顯,能很好地保護(hù)線粒體膜電位不受氧化損傷的影響,抑制神經(jīng)元凋亡。

AST可能通過多種途徑發(fā)揮抗氧化損傷的作用。AST不僅同其他類胡蘿卜素一樣在分子中存在共軛雙鍵鏈,而且在共軛雙鍵鏈末端的3和3′位置有不飽和酮基和羥基,因此具有更強(qiáng)的清除自由基的能力。另外,由于末端羥基的存在,使AST分子兩端親水,中間疏水,能嵌入生物膜的磷脂雙分子層,增加生物膜的機(jī)械強(qiáng)度,更好地防止自由基對膜的損傷〔10〕。AST還具有激活內(nèi)源抗氧化系統(tǒng)的能力,提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等內(nèi)源性抗氧化物酶的表達(dá)水平〔3〕。近來有文獻(xiàn)報(bào)道,AST能呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性的上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達(dá),從而對 Aβ25～35誘導(dǎo) PC12細(xì)胞的損傷起到明顯的保護(hù)作用〔11〕。

總之,本文初步確認(rèn)了AST對AD的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能和防止氧化應(yīng)激損傷和保護(hù)線粒體功能有關(guān)。但是,Aβ的神經(jīng)毒性機(jī)制和AST防治作用的機(jī)制需要深入研究。

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