周 波 文 敏 王文靜 何宇紅 余 彥 臧貴勇 焦 玲 張春林(貴陽醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004)

目前尚缺乏帕金森病(PD)的特異性治療方法,多年來一直以左旋多巴替代治療為主,但遠(yuǎn)期療效差,出現(xiàn)癥狀波動(dòng)、異動(dòng)癥以及精神癥狀等并發(fā)癥,不能延緩病程的發(fā)展和減少死亡率。因此發(fā)展長(zhǎng)期有效的治療方法,延緩病情進(jìn)展,提高PD患者生活質(zhì)量是目前亟待解決的問題。依達(dá)拉奉是一種廣泛運(yùn)用于缺血性腦卒中患者的氧自由基清除劑〔1〕,它可以通過抑制脂質(zhì)過氧化〔2〕和調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)〔3〕抑制細(xì)胞死亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用百草枯聯(lián)合代森錳建立PD小鼠模型,通過檢測(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元及糖原合成酶-3β(GSK-3β)的表達(dá),探討依達(dá)拉奉對(duì)PD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 模型建立 健康雄性C57BL/6小鼠30只,7周齡,體重24～26 g,由重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)于貴陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,室溫維持在(18±2)℃,濕度維持在(50±10)%,12/12光暗周期,自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)開始前先給予適應(yīng)環(huán)境1 w。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(10只)和依達(dá)拉奉治療組。模型組給予百草枯(10 mg/kg,Sigma公司)和代森錳(30 mg/kg,Sigma公司),溶于生理鹽水后腹腔注射,每周二、四早上各一次,連續(xù)6 w;依達(dá)拉奉治療組在成功建模后給予依達(dá)拉奉注射液(商品名:必存,3 mg/kg,先聲藥業(yè)提供)腹腔注射,1次/d,連續(xù)2 w;對(duì)照組給予同等劑量的生理鹽水。

1.2 敞箱實(shí)驗(yàn) 敞箱實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠的自主運(yùn)動(dòng)活性。自制敞箱,長(zhǎng) ×寬 ×高為 80 cm ×80 cm ×40 cm,底部刻出16 cm×16 cm的格子25個(gè)。內(nèi)壁涂黑。在安靜、光線較暗的環(huán)境中檢測(cè)。小鼠適應(yīng)環(huán)境10 min后計(jì)數(shù)3 min內(nèi)小鼠水平運(yùn)動(dòng)(移動(dòng)的格子數(shù))和垂直運(yùn)動(dòng)(雙前肢離開地面站立的次數(shù))。水平運(yùn)動(dòng)計(jì)分:動(dòng)物穿過1格(三爪以上跨入)為1分,如果沿直線走每10 cm為1分;垂直運(yùn)動(dòng)計(jì)分:動(dòng)物雙足離開地面為標(biāo)志,無論站立多長(zhǎng)時(shí)間直至放下雙足為1分。

1.3 標(biāo)本采集 用3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉動(dòng)物,在其左胸前壁縱行剪開心包,充分暴露心臟,經(jīng)心包橫竇引過一絲線,繞主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈根部打一松結(jié),剪開左心室,將套管插入升主動(dòng)脈中,結(jié)扎固定套管并立即開始灌注。先用生理鹽水50 ml(37℃)沖去血液,流速宜大,至右心室流出液體無色或略帶紅色,即可終止灌洗而改用固定液(4%多聚甲醛、飽和苦味酸、戊二醛)灌注,時(shí)間約30 min。灌注后開顱取腦,放入4%多聚甲醛固定24 h。經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋、冠狀連續(xù)切片,切片厚6 μ m,隔6取2,用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 TH和GSK-3β免疫組化(SABC法) ①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;②經(jīng)新鮮配制3%H2O210 min滅活內(nèi)源性酶;③用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù);④滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體,不洗;⑤滴加一抗?jié)窈兄?℃過夜;⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG,濕盒中37℃20 min;⑦滴加試劑SABC,濕盒中37℃20 min;⑧DAB顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間;⑨脫水、透明和封片,顯微鏡下觀察。各組切片均在相同時(shí)間、相同條件下完成免疫組織化學(xué)顯色。對(duì)照組切片用0.1 mol/L PBS取代一抗,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果判定:以胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性神經(jīng)元。

1.5 圖像分析 每只小鼠隨機(jī)選取5張切片,每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野,在同一視場(chǎng)面積,同一放大倍數(shù),同一背景光強(qiáng)度下采集圖像,運(yùn)用美國(guó)Mc公司Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量以及測(cè)定GSK-3β陽性反應(yīng)物積分光密度。

2 結(jié) 果

2.1 敞箱實(shí)驗(yàn) 敞箱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,模型組小鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)活性較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.05);依達(dá)拉奉治療后,運(yùn)動(dòng)活性較模型組有了顯著改善(P＜0.05),但與正常對(duì)照組間仍存在顯著差異(P＜0.05),見表1。

表1 各組小鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)比較(±s,n=10)

表1 各組小鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)比較(±s,n=10)

組別 水平運(yùn)動(dòng) 垂直運(yùn)動(dòng)正常對(duì)照組 120.33±5.85 18.667±3.08模型組 70.833±8.47 9.16±1.17依達(dá)拉奉治療組 100.4±20.24 12.2±0.84

2.2 TH免疫組織化學(xué)染色 TH免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖1):正常對(duì)照組小鼠在中腦腹側(cè)黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)可見許多TH陽性神經(jīng)元(107.83±7.885),細(xì)胞多為錐體形和三角形,胞漿內(nèi)棕色顆粒濃;模型組小鼠黑質(zhì)致密部和腹側(cè)被蓋區(qū)TH陽性細(xì)胞顯著減少(36.17±4.082),較正常組減少約66.5%,胞漿內(nèi)染色極為淺淡。依達(dá)拉奉治療后TH陽性細(xì)胞有了顯著回升,但數(shù)量上仍比正常對(duì)照組少(84.67±4.082),且染色也較正常對(duì)照組淺淡。

圖1 各組小鼠黑質(zhì)TH免疫組織化學(xué)染色(SABC法,×100)

2.3 GSK-3β免疫組織化學(xué)染色 GSK-3β免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖2):正常對(duì)照組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿呈淡棕色,GSK-3β積分光密度值較低(0.195 14±0.006 98),蛋白表達(dá)水平較低;模型組大量胞漿呈深棕色,GSK-3β積分光密度值顯著升高(0.284 92±0.008 60),蛋白高表達(dá)。依達(dá)拉奉治療后GSK-3β蛋白表達(dá)顯著降低(0.243 39±0.004 91)。

圖2 各組小鼠黑質(zhì)GSK-3β免疫組織化學(xué)染色(SABC法,×400)

3 討 論

近年來由于除草劑等環(huán)境毒素在鄉(xiāng)村的大量使用,鄉(xiāng)村PD的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。環(huán)境毒素在PD中的作用日益受到關(guān)注。百草枯是世界上最為常用的除草劑之一,由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)與MPTP的活性物質(zhì)MPP+(一種非自然產(chǎn)生的神經(jīng)毒素,能夠引起人類及動(dòng)物產(chǎn)生帕金森病)極為相似,自2007年起已經(jīng)被美國(guó)等13個(gè)國(guó)家禁用或限用,但在我國(guó)仍廣泛使用〔4〕。代森錳是一種除真菌劑,與百草枯的使用存在地域上的重疊,能夠加劇多巴胺神經(jīng)元的丟失和運(yùn)動(dòng)障礙〔5〕。因此,聯(lián)合百草枯與代森錳建立小鼠PD模型,既符合我國(guó)國(guó)情,又符合PD多環(huán)境因素致病的學(xué)說。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/酪氨酸酶,廣泛分布于哺乳動(dòng)物腦組織,涉及wnt、PI3K/AKT,G蛋白復(fù)合受體等信號(hào)傳導(dǎo)通路,通過磷酸化代謝酶、信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控,與PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔6〕。GSK-3β現(xiàn)已被作為糖尿病、阿爾茨海默病等多種疾病的治療靶標(biāo)〔7〕。Takashima 等〔8〕在阿爾茨海默病、FTDP-17 等神經(jīng)退行性疾病的研究中發(fā)現(xiàn),激活GSK-3β導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元丟失;抑制GSK-3β將抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元丟失?；谏鲜鲅芯?GSK-3β抑制劑成為了當(dāng)前AD和其他神經(jīng)退行性病藥物治療的發(fā)展方向。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,依達(dá)拉奉能夠顯著改善百草枯聯(lián)合代森錳引起的小鼠運(yùn)動(dòng)能力減退,黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量減少和GSK-3β表達(dá)增高。可見,依達(dá)拉奉對(duì)PD有較好的治療作用,其機(jī)制可能是通過抑制GSK-3β的表達(dá),進(jìn)而抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡,這與 Wu等〔9〕通過促紅細(xì)胞生成素(EPO)抑制GSK-3β活性,降低 caspase-3表達(dá),從而保護(hù)PC12細(xì)胞免受MPP+引起的細(xì)胞凋亡相一致。雖然依達(dá)拉奉可能成為PD治療比較有希望的選擇,但仍然有很多關(guān)鍵的問題還不清楚,如治療的最佳時(shí)機(jī)和劑量等,還有待于進(jìn)一步的研究。

1 Shichinohe H,Kuroda S,Yasuda H,et al.Neuroprotective effects of the free radical scavenger Edaravone(MCI-186)in mice permanent focal brain ischemia〔J〕.Brain Res,2004;1029(2):200-6.

2 Bates B,Hirt L,Thomas SS,et al.Neurotrophin-3 promotes cell death induced in cerebral ischemia,oxygen-glucose deprivation,and oxidative stress:possible involvement of oxygen free radicals〔J〕.Neurobiol Dis,2002;9(1):24-37.

3 Chen JX,Zhao T,Huang DX.Protective effects of edaravone against cobalt chloride-induced apoptosis in PC12 cells〔J〕.Neurosci Bull,2009;25(2):67-74.

4 Cicchetti F,Drouin-Ouellet J,Gross RE.Environmental toxins and Parkinson′s disease:what have we learned from pesticide-induced animal models〔J〕？Trends Pharmacol Sci,2009;30(9):475-83.

5 Fei Q,Ethell DW.Maneb potentiates paraquat neurotoxicity by inducing key Bcl-2 family members〔J〕.J Neurochem,2008;105(6):2091-7.

6 Takashima A.Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway:role of GSK-3beta in adult brain〔J〕.J Pharmacol Sci,2009;109(2):174-8.

7 Ojo KK,Gillespie JR,Riechers AJ,et al.Glycogen synthase kinase 3 is a potential drug target for African trypanosomiasis therapy 〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2008;52(10):3710-7.

8 Takashima A.GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis,2006;9(3):309-17.

9 Wu Y,Shang Y,Sun S,et al.Erythropoietin prevents PC12 cells from 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosis via the Akt/GSK-3beta/caspase-3 mediated signaling pathway〔J〕.Apoptosis,2007;12(8):1365-75.