陳澤鵬，鄧建朝，陳偉明，萬樹青*

（1.廣東省煙草公司，廣州 510600；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642）

二氯喹啉酸（Quinclorac）是由德國巴斯夫公司開發(fā)的新型喹啉酸類激素型除草劑，主要用于水稻插秧前后的稗草和其他雜草的防除，是我國稻田使用的主要除草劑[1-3]。由于二氯喹啉酸在土壤中的殘留時(shí)間較長，不易降解，因而對許多后茬敏感作物的生長造成一定的影響。

1999—2002年，廣東省部分煙區(qū)出現(xiàn)煙草畸形生長現(xiàn)象，結(jié)果造成烤煙品質(zhì)下降，受害嚴(yán)重的煙田無煙葉可收。后經(jīng)分析，致畸原因?yàn)橥寥乐袣埩舳揉醄4-6]。作者經(jīng)多次深入田間觀察發(fā)現(xiàn)，凡畸形生長的煙草田塊，很難找到受其他病害侵襲的煙株。為了弄清原因，在開展致畸機(jī)理研究的同時(shí)，對畸形煙葉的耐病性因子也展開了一些探索。在二氯喹啉酸化學(xué)脅迫下，檢測煙草體內(nèi)保護(hù)酶特別是SOD和POD活性的變化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了二氯喹啉酸不同濃度、不同時(shí)間處理后煙草體內(nèi) SOD活性和POD活性動(dòng)態(tài)變化，以了解煙草畸形生長與保護(hù)酶活性變化的關(guān)系，對深入了解二氯喹啉酸對煙草毒害效應(yīng)的機(jī)理以及誘導(dǎo)抗病性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草（Nicotiana tabacumL.）品種為 K326。溫室播種，育苗，于3～4片真葉期移栽。

供試藥劑為50%二氯喹啉酸可濕性粉劑，由江蘇新沂中凱農(nóng)用化工有限公司生產(chǎn)。采用盆栽法，在土中分別混入 0（CK）、1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和 1.67×10-2mg/kg 二氯喹啉酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定 參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法[7]，稍作改動(dòng)。酶液制備：取第4片展開煙草葉片，去中脈，準(zhǔn)確稱取0.30 g（共3份）于預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的提取介質(zhì)1.5 mL（分3次加入，1次研磨，2次沖洗），在冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，-4 ℃13 000 rpm下冷凍離心20 min，上清液即為SOD粗提液。

顯色反應(yīng)：取透明度好、質(zhì)地相同的試管，樣品測定管和對照管（一支遮光，2支照光），按表1加入試劑。

表1 顯色反應(yīng)試劑配置Table 1 The formula of color reaction reagent

混勻后，給1支對照管罩上比試管稍長的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓c其他各管同時(shí)置于4 000 lx紫外燈下反應(yīng) 5 min（要求各管照光情況一致，反應(yīng)溫度控制在 25～35 ℃之間，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間）。

樣品超氧化物歧化酶活性的測定：

至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，終止反應(yīng)。以遮光的對照管作為空白，分別在560 nm波長下測定各管的吸光度，按下式計(jì)算SOD活性。

式中：SOD總活性以每克鮮重酶單位表示。A0—照光對照管的光吸收值，As—樣品管的光吸收值，V1—樣液總體積（mL），VT—測定時(shí)樣品用量（mL），W—樣品鮮重（g）。

1.2.2 超氧化物歧化同工酶的測定 參照參考文獻(xiàn)[7]的方法。采用聚丙烯酰胺垂直板電泳技術(shù)。分離膠濃度為10%，濃縮膠為3%。電極緩沖系統(tǒng)pH 7.8磷酸緩沖液，酶的進(jìn)樣量30 μL，電泳是在4 ℃的冰箱中進(jìn)行，電泳時(shí)間為 4h。0顯色后照相，測量各酶帶的Rf值。

1.2.3 過氧化物酶（POD）活性測定 參照參考文獻(xiàn)[8]的方法。準(zhǔn)確稱取所測葉片0.3 g于預(yù)冷的研缽中，加入預(yù)冷的Tris2HCl緩沖液（pH 8.5）1.5 mL，冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，-4℃，13 000 r/min 下離心20 min，取上清液分析。反應(yīng)體系中加入2.8 mL含18 mmol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液和0.1 mL的酶提液（對照用0.1 mL的磷酸緩沖液代替）；最后再加入0.1 mL的1%雙氧水溶液。按酶活性連續(xù)記錄法用1 cm比色皿測定反應(yīng)體系在470 nm處的吸光度OD470；每個(gè)樣品重復(fù)3次，酶活性以單位鮮重葉片在單位時(shí)間內(nèi)光密度的變化值表示(OD/g?min)。根據(jù)處理和對照所測的酶活力的變化，計(jì)算酶活力影響率，即：酶活力抑制或激活率/%=[(對照酶活力-處理酶活力)/對照酶活力]×100。若所得值為負(fù)值，表明為激活效應(yīng)。

1.2.4 過氧化物同工酶測定 參考鄒琦的方法[7]，采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)。濃縮膠濃度為3%，分離膠濃度7.5%，電極緩沖系統(tǒng)pH 8.3（Tris甘氨酸緩沖液），上樣量每孔30 μL，穩(wěn)壓電泳，在開始電泳時(shí)，調(diào)節(jié)電壓80 V，0.5 h后變?yōu)?00 V。整個(gè)電泳過程在冰箱中進(jìn)行，歷時(shí)3～4 h。顯色后照相，測量各酶帶的Rf值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2000軟件處理，并用SAS國際通用統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，對試驗(yàn)結(jié)果用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法（Duncan,s Muitiple Range Test，DMRT）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 二氯喹啉酸對煙草超氧化物歧化酶活性的影響

從圖1可以看出，移栽后14 d，二氯喹啉酸濃度為 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3、1.67×10-2mg/kg處理煙草SOD活性較對照有升高趨勢，分別較對照提高9.21%、32.60%、109.36%、136.16%、151.94%。移栽后 21 d，處理與對照差異不顯著。

圖1 二氯喹啉酸對煙草葉片SOD活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic reaction of SOD in tobacco treated with quinclorac

2.2 二氯喹啉酸對煙草超氧化物歧化同工酶的影響

從圖2看出，煙草的超氧化物酶帶有4條，相對遷移率 Rf分別為 0.49（Rf1）、0.55（Rf2）、0.58（Rf3）、0.63（Rf4）。不同濃度二氯喹啉酸處理煙草30 d的超氧化物酶活性較對照差異不顯著。

圖2 二氯喹啉酸處理煙葉30 d的超氧化物歧化酶凝膠電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of SOD in tobacco treated with quinclorac after 30d

2.3 二氯喹啉酸對煙草過氧化物酶活性的影響

從圖3看出，當(dāng)移栽后28 d，不同濃度處理的煙草葉片酶活力達(dá)到一個(gè)峰值，對照和二氯喹啉酸濃度分別為 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和1.67×10-2mg/kg處理的煙草，其過氧化物酶活力分別為17.47、29.61、23.73、30.33、41.00、57.73 OD/（g?min-1），各處理的煙草葉片中過氧化物酶活性比對照分別提高69.47%、35.80%、73.61%、134.69%、230.45%。35 d所測結(jié)果表明，除1.67×10-2mg/kg濃度的煙草酶活力略有降低外，其他均呈上升趨勢（圖3），表明煙草經(jīng)二氯喹啉酸處理后，過氧化物酶的活力有所提高。

圖3 二氯喹啉酸對煙草葉片POD活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic reaction of POD in tobacco treated with quinclorac

2.4 二氯喹啉酸對煙草過氧化物同工酶的影響

從圖4看出，二氯喹啉酸不同處理與對照相比，煙根酶帶形態(tài)存在一定的差異。凡處理的煙草根共顯現(xiàn)9條酶帶，相對遷移率Rf分別為0.09（Rf1）、0.13（Rf2）、0.19（Rf3）、0.24（Rf4）、0.31（Rf5）、0.35（Rf6）、0.37（Rf7）、0.63（Rf8）、0.66（Rf9）。二氯喹啉酸處理的煙根與對照相比還新增一條酶帶 Rf1，且二氯喹啉酸處理后的酶帶顏色較對照明顯加深。隨著二氯喹啉酸施用量的增加，酶帶變寬，顯色加重，說明酶活性有所上升。二氯喹啉酸處理的煙葉誘導(dǎo)過氧化物同工酶活性與根所表現(xiàn)的活性趨于一致，不同的是誘導(dǎo)同工酶酶帶為10條[9]。

圖4 二氯喹啉酸處理煙草根的過氧化物酶凝膠電泳圖Fig.4 The electrophoretogram of POD in tobacco root treated with quinclorac

3 討 論

水稻與煙草輪作煙區(qū)，由于水田施用二氯喹啉酸防除稗草，殘留土壤中的二氯喹啉酸可引起后茬煙草出現(xiàn)畸形生長[4]。從畸形的形態(tài)分析，煙草葉面向內(nèi)褶，葉色加深，嚴(yán)重時(shí)葉面僅存葉脈而無葉肉組織。盆栽試驗(yàn)也表明，在不同濃度和時(shí)間下，二氯喹啉酸對煙草葉長和葉寬具有顯著的抑制效應(yīng)，這些癥狀表明，二氯喹啉酸對煙草致畸作用是與抑制細(xì)胞分裂有關(guān)。但這種畸形植株不會枯萎死亡，而同樣條件下的靶標(biāo)植物稗草可出現(xiàn)枯萎死亡現(xiàn)象。兩種植物對二氯喹啉酸表現(xiàn)出不同的中毒反應(yīng)，表明煙草對二氯喹啉酸有一種解毒機(jī)制。通過檢測二氯喹啉酸對煙草兩種保護(hù)酶的反應(yīng)表明，在二氯喹啉酸長時(shí)間的脅迫條件下，能誘導(dǎo)激活煙草保護(hù)酶的活性，測得不同濃度下，二氯喹啉酸隨著濃度升高，POD活性提高，在1.67×10-2mg/kg下，移栽28 d后可提高230%。SOD的活性在移栽后14 d達(dá)到峰值。由于保護(hù)酶具有清除自由基毒害的功能，在一定范圍內(nèi)減輕由此產(chǎn)生的氧自由基給機(jī)體造成的損傷，使之維持煙草生活的狀態(tài)，POD和SOD在一定程度上活性都有升高，從而在清除煙草體內(nèi)自由基中起到重要的作用。

試驗(yàn)中二氯喹啉酸的化學(xué)脅迫使得煙草內(nèi)保護(hù)酶系（SOD和 POD）活性提高，而且畸形煙草幾乎未發(fā)現(xiàn)感染真菌和細(xì)菌病害。由此可以得出推論，二氯喹啉酸的化學(xué)脅迫可以誘導(dǎo)畸形煙草內(nèi)SOD和POD酶活性提高，同時(shí)增強(qiáng)了煙草抗病的能力。當(dāng)然保護(hù)酶系還包括苯并氨酸解氨酶（PAL）,多酚氧化酶（PPO）等，要具體明確二氯喹啉酸與誘導(dǎo)抗病效應(yīng)之間的關(guān)系，還需要進(jìn)一步對二氯喹啉酸對PAL和PPO酶活性的影響進(jìn)行研究。該研究對于尋找誘導(dǎo)煙草抗病物質(zhì)，提高植物潛在的抗病能力給了我們新的啟示。

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