黃志洪 ，盧玉忠，李慎果，覃 湛，張兆磊，袁少英*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院藥劑科，廣東珠海 519015；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)V東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院男科，廣東珠海 519015

近年來，慢性前列腺炎發(fā)病率有增高的趨勢(shì)，中青年男性發(fā)病率高，且缺乏有效的治療方法和藥物。我院男科根據(jù)多年臨床與實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)出治療慢性前列腺炎的系列中藥方劑，其中丹紅通精方對(duì)氣滯血瘀型前列腺炎療效明顯[1]，為尋找其治療作用的機(jī)理，筆者通過丹紅通精方對(duì)自身免疫性慢性前列腺炎大鼠血液及前列腺組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 10（IL-10）水平影響的實(shí)驗(yàn)研究來探討?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 Wistar大鼠，8～10 周齡，體重 250～300 g，清潔級(jí)。

1.2 主要試劑

福氏完全佐劑（FCA）；卡介苗；百白破疫苗；0.5%TritonX 2100（內(nèi)皮細(xì)胞損傷劑）的生理鹽水（自配）；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS緩沖液）；乙醚；酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）試劑盒（北京晶美生物工程有限公司）；RNA抽提劑（Trizol）（美國(guó)Invitrogen公司）；氯仿和異丙醇；實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀（Roche公司）；內(nèi)參照TNF-α、IL-10的陽性模板標(biāo)準(zhǔn)品（上海博亞生物公司）；內(nèi)參照TNF-α、IL-10的特異性引物（上海生物工程技術(shù)公司）；熒光染料SYBR GreenⅠ（Bio-Rad公司）；RNA 提取試劑盒（QIAGEN 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）；DNA聚合酶（大連寶生物工程公司）。

1.3 大鼠前列腺蛋白提純液的制作

取雄性Wistar大鼠10只，處死后再剝?nèi)∑淝傲邢俳M織，加入含0.5%Triton X 2100（內(nèi)皮細(xì)胞損傷劑）的生理鹽水溶液，勻漿離心后，取上清液，用721分光光度計(jì)，以牛血清白蛋白溶液為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用雙縮脲法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，最后用0.1 mol/L PBS緩沖液稀釋為15 mg/ml濃度的溶液。

1.4 福氏完全佐劑（FCA）的制備

將液體石蠟與羊毛脂按2∶1比例，共熱至70℃，混勻，高溫滅菌后按5 mg/ml濃度加入佐劑用卡介苗，無菌乳化后使用。

1.5 丹紅通精方混懸液的制備

丹紅通精方主要由以下方藥組成：丹參1包、桃仁1包、紅花1包、水蛭1包、川牛膝1包、紅景天1包、穿破石1包、失笑散1包、牡蠣1包、黃芪1包，采用江蘇天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒組成的協(xié)定方劑。丹紅通精方混懸液的制備過程如下：取丹紅通精方1劑，加入100℃開水300 ml，充分溶解方中藥物顆粒，待冷卻備用。

1.6 動(dòng)物分組及造模

40只大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組（n=10）、低劑量實(shí)驗(yàn)組（n=10）、中劑量實(shí)驗(yàn)組（n=10）及高劑量實(shí)驗(yàn)組（n=10）。 除空白對(duì)照組外，其他各組均采用下述方法造模：將實(shí)驗(yàn)大鼠采用乙醚麻醉，腹腔注射百白破疫苗0.5 ml，多點(diǎn)皮內(nèi)注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA乳劑（比例為1∶1的混懸液）1.0 ml?？瞻讓?duì)照組分別行腹腔及皮內(nèi)多點(diǎn)注射生理鹽水注射液0.5、1.0 ml。 以上各組均分別于第 0、30 天行第 2 次注射[2]。 第45天可以出現(xiàn)特異性的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)改變。

1.7 給藥方法

造模成功1周后，開始按下述劑量給藥：空白對(duì)照組給予生理鹽水 10 ml/（kg·d），灌胃，1 次/d；低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組：分別給予丹紅通精方混懸液 5、10、15 ml/（kg·d）灌胃，1次/d。各組均連續(xù)給藥35 d，每日觀察其活動(dòng)、進(jìn)食等情況，35 d后處死動(dòng)物，并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.8 酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）

末次給藥后24 h，將實(shí)驗(yàn)大鼠采用乙醚麻醉，頸動(dòng)脈取血，采用雙抗體夾心ELISA法定量分析各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的表達(dá)，其中，試劑盒的操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

取血后，同時(shí)斷頭處死各組大鼠，剝離前列腺并稱重，1/3組織置焦碳酸二乙酯（DEPC）水中漂洗3次，迅速入液氮保存待，提取總RNA。根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書提取前列腺組織總RNA及制備cDNA。TNF-α、IL-10 PCR引物根據(jù)相關(guān)基因的大鼠cDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。見表1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前列腺肉眼觀

未見各組大鼠前列腺形態(tài)，大小，顏色有明顯差別，各組均未發(fā)現(xiàn)前列腺與周圍組織粘連。

表1 PCR引物序列

2.2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的測(cè)定

結(jié)果表明丹紅通精方對(duì)前列腺濕重及前列腺指數(shù)（前列腺濕重/體重比）影響較小，各組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

2.3 TNF-α、IL-10在各組大鼠血清中的水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，在自身免疫性慢性前列腺炎模型中，給予中、高劑量的丹紅通精方混懸液能導(dǎo)致大鼠血清TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和低劑量實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或 P＜0.05）。 見表3。

2.4 TNF-α、IL-10在各組大鼠前列腺組織中的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，在自身免疫性慢性前列腺炎的發(fā)生發(fā)展過程中，前列腺組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)量明顯高于正常，且與低劑量實(shí)驗(yàn)組相比較，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)量的升高更明顯。說明丹紅通精方能提高前列腺蛋白提純液誘導(dǎo)的自身免疫性慢性前列腺炎大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平，并且與低劑量丹紅通精方實(shí)驗(yàn)組相比較，給予中、高劑量丹紅通精方實(shí)驗(yàn)組的作用更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或 P＜0.05）。 見表4。

表2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s）

表2 各組大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)的比較（±s）

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表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的含量（±s，ng/L）

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-10的含量（±s，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 只數(shù)10101010空白對(duì)照組低劑量實(shí)驗(yàn)組中劑量實(shí)驗(yàn)組高劑量實(shí)驗(yàn)組TNF-α 20.18±9.1223.89±8.07111.46±6.71▲*138.52±5.75▲▲**IL-1086.78±30.2594.99±35.02130.17±43.61▲*195.22±56.34▲▲**

表4 各組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)情況（±s，ng/L）

表4 各組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-10mRNA的表達(dá)情況（±s，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，*P<0.05，**P<0.01

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3 討論

目前慢性前列腺炎的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，很多學(xué)者認(rèn)為該病與細(xì)胞因子密切相關(guān)[3]，并對(duì)此展開了一系列的研究。丹紅通精方對(duì)于治療氣滯血瘀型慢性前列腺炎已卓有成效。本研究中所用的丹紅通精方，方中蒲黃、五靈脂、水蛭、紅景天、黃芪為君藥，其中，蒲黃、五靈脂活血祛瘀，散結(jié)止痛，水蛭消瘀血于無形，紅景天既可益氣健脾，又能活血化瘀，黃芪補(bǔ)氣升陽，托毒排膿；紅花、丹參、桃仁為臣藥，可活血止痛；牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)、穿破石活血通絡(luò)為佐藥；川牛膝引藥下行兼有活血之功為使藥。全方共奏活血化瘀、行氣止痛、扶正益氣之功。

現(xiàn)有文獻(xiàn)[4]表明，調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子、抗炎癥細(xì)胞因子、促炎癥細(xì)胞因子都參與了前列腺炎的免疫反應(yīng)，出現(xiàn)了異常的變化，其中具有代表性的是IL-8、IL-10、TNF-α等。慢性前列腺炎實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物前列腺組織中IL-8、IL-10、TNF-α等炎癥因子水平均會(huì)有不同程度升高，說明模型動(dòng)物存在自身免疫后的炎癥反應(yīng)。在許多由感染引起的慢性前列腺炎病例中，TNF-α可能在隨后的宿主防御中起重要作用，發(fā)揮抗感染效應(yīng)。在前列腺局部，TNF-α可以激活中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，刺激它們合成IL-1、IL-6、IL-8和TNF，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[5-6]。IL-10是人類免疫應(yīng)答中已發(fā)現(xiàn)的最重要的抗炎癥因子，主要由單核巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子。在人類，它抑制單核吞噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子[7]。IL-10水平和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）水平成正相關(guān)（P<0.05）。NGF被認(rèn)為是和CP/CPPS的疼痛癥狀有密切關(guān)系的因子，是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)對(duì)痛覺感受的靈敏度[6]。

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，丹紅通精方能提高自身免疫性前列腺炎大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平 （P<0.05或P<0.01），并且中、高劑量給藥組大鼠血清及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平升高更明顯（P<0.05或P<0.01）。既往相關(guān)研究結(jié)合本實(shí)驗(yàn)表明，丹紅通精方對(duì)改善自身免疫性前列腺炎具有顯著作用，其機(jī)制與提高模型大鼠血液及前列腺組織中TNF-α、IL-10水平有關(guān)。

[1]黃志洪,袁少英,覃湛,等.丹紅通精方治療氣滯血瘀型慢性前列腺炎的臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009,6(4):73-75.

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[3]劉海紅,夏欣一,黃宇烽.慢性前列腺炎與細(xì)胞因子研究進(jìn)展[J].中華男科學(xué)雜志,2006,12(6):548-550,554.

[4]王洪志,劉朝東,韋超.TNF-α和IL-10在慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠中的表達(dá)及意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,34(9):1187-1190.

[5]溫志鵬,洪志明,林星游,等.前列活血湯對(duì)自身免疫性前列前列腺內(nèi)炎性細(xì)胞因子的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(5):396-399.

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[7]王云鵬.細(xì)胞因子與慢性前列腺炎關(guān)系的研究現(xiàn)狀[J].臨床誤診誤治,2007,20(9):53-56.