崔艷麗,武 峰(1.北京市石景山醫(yī)院藥劑科,北京 100043;.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院臨床藥理基地,北京 100730)
萬古霉素、去甲萬古霉素同屬三環(huán)糖肽類抗生素,對(duì)革蘭陽性細(xì)菌有強(qiáng)大的抗菌作用,尤其對(duì)目前臨床較為棘手的嚴(yán)重耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染有較好療效,且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性,因而深受臨床重視。由于萬古霉素和去甲萬古霉素具有耳、腎毒性,臨床應(yīng)用時(shí)常需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)(TDM),特別是對(duì)于老年患者和腎功能不全者,需通過TDM來及時(shí)調(diào)整給藥方案,以避免耳、腎功能損害。萬古霉素、去甲萬古霉素的血藥濃度測(cè)定方法,已報(bào)道的有微生物法、熒光偏振免疫法和高效液相色譜法(HPLC)等。本研究擬通過建立適宜的HPLC-UV法,同時(shí)快速測(cè)定血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度,以用于臨床TDM及藥代動(dòng)力學(xué)研究。
萬古霉素對(duì)照品,含量:100%;去甲萬古霉素對(duì)照品,含量:83.4%,均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。
Hp1100型高效液相色譜儀,含 G1311A型四元泵、G1313A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314A型紫外檢測(cè)器、Agilent色譜工作站,Agilent公司。
精密稱取去甲萬古霉素及萬古霉素對(duì)照品,去離子水充分溶解得標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中去甲萬古霉素/萬古霉素的濃度為400/460 μg·mL-1。取不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別以空白人血清稀釋至濃度為 80.7/92.0、40.4/46.0、20.2/23.0、8.1/9.2、4.0/4.6、2.0/2.3、0.8/0.9 μg·mL-1(去甲萬古霉素/萬古霉素)的血清標(biāo)本。同時(shí)稀釋得低、中、高3種濃度的質(zhì)控血清標(biāo)本,使其濃度分別為 57.7/65.7、14.1/16.1、3.0/3.5 μg·mL-1。
流動(dòng)相:50 mM KH2PO4緩沖液∶乙腈 =90∶10(pH=2.5);色譜柱:Phenomenex C18柱(150 ×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長:236 nm;柱溫:25 ℃。
取待測(cè)樣本 200 μL,加入 6% 高氯酸 180 μL,漩渦混合2 min,13 000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min;取上清液 300 μL,加入1.5 mm NaOH溶液 40 μL,漩渦混合 1 min,取上清液 20 μL 進(jìn)樣測(cè)定。
在本實(shí)驗(yàn)條件下,萬古霉素和去甲萬古霉素分離度良好,無血清內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。去甲萬古霉素的保留時(shí)間約為6 min;萬古霉素的保留時(shí)間約為8 min,血清色譜圖見圖1。
圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素的血清色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of serum vancomycin and norvancomycin
測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本,以去甲萬古霉素/萬古霉素的峰面積為縱坐標(biāo),樣本濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線形回歸。結(jié)果顯示:去甲萬古霉素在0.8 ~80 μg·mL-1,萬古霉素 0.9 ~92 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi),呈良好的線性。去甲萬古霉素的線性方程為:Y=10.678X-0.615,r=0.999 98;萬古霉素的線性方程為:Y=8.597X+5.585,r=0.999 94。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,本實(shí)驗(yàn)的定量下限為去甲萬古霉素 0.8 μg·mL-1,萬古霉素0.9 μg·mL-1。
分別測(cè)定低、中、高3種濃度的血清質(zhì)控標(biāo)本各5組,計(jì)算準(zhǔn)確度和日內(nèi)精密度(RSD);連續(xù)測(cè)定5日,計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示,本方法測(cè)定血清去甲萬古霉素/萬古霉素的準(zhǔn)確度分別為97.79% ~104.82%及96.49% ~110.75%;日內(nèi)、日間精密度均<8%,見表1。
取低、中、高3種濃度的血清質(zhì)控標(biāo)本各3組,處理后將上清液在室溫分別放置4、24、48 h后重復(fù)測(cè)定,計(jì)算變異系數(shù)(CV%);將配制好的血清質(zhì)控標(biāo)本置于-40℃冰箱分裝保存,每隔1周重復(fù)測(cè)定1次,其中低、中、高濃度各測(cè)定3組,計(jì)算CV%。結(jié)果顯示,去甲萬古霉素和萬古霉素的血清標(biāo)本在上述情況下穩(wěn)定性良好,測(cè)定值CV%均<10%,見表2。
表1 血清去甲萬古霉素/萬古霉素的準(zhǔn)確度及精密度(n=5)Tab 1 Degree of accuracy and precision of vancomycin and norvancomycin in serum(n=5)
表2 血清去甲萬古霉素/萬古霉素的穩(wěn)定性Tab 2 Stability of vancomycin and norvancomycin in serum
目前臨床上主要應(yīng)用熒光偏振免疫法(FPIA)測(cè)定血清萬古霉素的藥物濃度。盡管FPIA法具有操作簡(jiǎn)便,精密度高等諸多優(yōu)點(diǎn),但有國外文獻(xiàn)認(rèn)為[1,2],與 HPLC法相比,F(xiàn)PIA法所測(cè)萬古霉素濃度值容易偏高,其原因可能是由于萬古霉素的降解產(chǎn)物(CDP-1)與萬古霉素發(fā)生交叉反應(yīng)。在慢性腎功能不全的患者,由于萬古霉素排泄顯著延長,體內(nèi)CDP-1產(chǎn)生增多,F(xiàn)PIA所測(cè)濃度值偏高更易發(fā)生。日本學(xué)者Tanaka等的研究表明,在血透患者中,測(cè)定值偏高的情況更為明顯[1]。此外,F(xiàn)PIA標(biāo)準(zhǔn)血樣的穩(wěn)定性也可能影響測(cè)定結(jié)果,Morishige等人[2]曾對(duì)FPIA標(biāo)準(zhǔn)血樣穩(wěn)定性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示,在4℃和25℃貯存30 d后,萬古霉素含量分別下降20%和60%。因此,有必要建立快速、準(zhǔn)確的HPLC法,以應(yīng)用于萬古霉素以及去甲萬古霉素的臨床TDM以及藥代動(dòng)力學(xué)研究。
有關(guān)萬古霉素和去甲萬古霉素測(cè)定的HPLC方法,國內(nèi)外文獻(xiàn)中多采用反向色譜法和離子對(duì)色譜法[3-6]。由于離子對(duì)色譜法存在平衡時(shí)間長,不易洗脫等缺點(diǎn),故本研究采取了的反向色譜法。在流動(dòng)相的組成上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn),采用乙腈為有機(jī)相,調(diào)節(jié)其與水相的比例為10∶90,并將pH值調(diào)至2.5,使萬古霉素和去甲萬古霉素與血清雜質(zhì)分離完全,且峰形良好,保留時(shí)間合理,提高了檢測(cè)效率。在檢測(cè)波長的選擇上,本文對(duì)比了280 nm(《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的檢測(cè)波長)和文獻(xiàn)中多采用的236 nm,發(fā)現(xiàn)兩藥在236 nm的吸收度均較280 nm處更為理想。
有關(guān)血樣處理方法,國內(nèi)文獻(xiàn)中曾使用乙腈:異丙醇沉淀血樣后,再用氯仿或二氯甲烷萃取上清液的方法進(jìn)行血樣提取,但提取方法較為繁瑣[3]。也有學(xué)者采用10%硫酸鋅溶液[4]和10%三氯乙酸溶液[5]直接沉淀血清蛋白的方法,但前者沉淀蛋白不完全,后者則內(nèi)源性干擾較多以致無法完全色譜分離。本實(shí)驗(yàn)采用6%高氯酸作為沉淀劑直接沉淀蛋白,蛋白沉淀完全,操作簡(jiǎn)單,且消耗血量極少(200 μL)。但由于高氯酸的強(qiáng)酸性可造成藥物在上清液的穩(wěn)定性減低,故本文采用NaOH調(diào)節(jié)上清液的pH值。
有文獻(xiàn)報(bào)道,去甲萬古霉素在血清中容易降解,穩(wěn)定性較差[7]。本研究對(duì)不同濃度的血清質(zhì)控樣本進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,血清樣本處理后上清液在室溫放置48 h,以及血清標(biāo)本-40℃保存3周,去甲萬古霉素和萬古霉素的穩(wěn)定性均符合要求。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定去甲萬古霉素和萬古霉素的血藥濃度,方法快速簡(jiǎn)捷、靈敏度高,經(jīng)考察準(zhǔn)確度和精密度良好,可滿足臨床開展TDM和進(jìn)行人體藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。
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