邢鳳晶，張 偉，傅曉鐘，蘭燕宇，王愛(ài)民，王永林，李 靖，周 雯，劉 影

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

研究證實(shí)，氧化損傷是神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)與血管性癡呆(vascular dementia，VD)等產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[1-2]。燈盞乙素可顯著改善海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)，減輕腦組織的過(guò)氧化損傷[3]，從而對(duì)神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要價(jià)值，但其水溶性差(0.056 g/L)、脂溶性差、pH=4.2的磷酸鹽緩沖液中l(wèi)ogP為-2.56、口服生物利用度低(0.4%)等缺陷，使其推廣應(yīng)用受到較大限制[4-5]?？诜舯K乙素后，其體內(nèi)真正的吸收與藥效形式是燈盞乙素苷元[6];在氨基酸結(jié)構(gòu)的氨基和羧基之間引入苯環(huán)，能有效克服氨基酸衍生物因鄰近氨基與羧基的參與而在弱酸環(huán)境下易水解的缺點(diǎn)，提高前藥的化學(xué)穩(wěn)定性[7]。筆者以燈盞乙素苷元為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期達(dá)到改善其理化性質(zhì)與提高抗氧化活性的目的，并對(duì)受試化合物進(jìn)行了初步體外活性檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Varian INOVA-400M型核磁共振儀(美國(guó)Varian);ACQUITY TQD型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters);LC-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津)，Hedera ODS-2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)。4- 氯甲基苯甲酸(批號(hào)為 16318)、二氯二苯甲烷(批號(hào)為20101028)均為南京康滿(mǎn)林化工有限公司產(chǎn)品;二甲氨基吡啶(批號(hào)為 T20090928)、DEME(批號(hào)為 F20090218)、二乙胺(批號(hào)為T(mén)20090122)、芐胺(批號(hào)為F20070618)、嗎啉(批號(hào)為11033)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;分離用硅膠(未說(shuō)明者均為200～300目，青島海洋化工分廠);PC12細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所);維生素E(Sigma公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司);乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 化合物的合成

2.1.1 合成路線

合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 目標(biāo)化合物的合成路線

2.1.2 合成步驟

6，7-羥基縮酮保護(hù)燈盞乙素苷元的制備:將燈盞乙素苷元0.2 g(0.7 mmol)溶于 10 mL 二甘醇二甲醚(DME)中，加入二甲氨基吡啶(DMAP)0.1 g(0.81 mmol)，加入二氯二苯甲烷 0.49 g(21 mmol)，180℃條件下，回流反應(yīng)2 h。溶劑減壓蒸盡，殘余物經(jīng)硅膠柱層析分離(洗脫劑為氯仿∶甲醇=80∶1)，得淺棕黃色粉末狀固體 0.22 g，熔點(diǎn)(mp)250 ～252 ℃，收率 68.4%。

N，N-取代氨甲基苯甲酸(4a～4c)的合成:室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下將對(duì)氯甲基苯甲酸(4 g，23.4 mmol)置500 mL三頸瓶中，加入40 mL無(wú)水乙醇，向反應(yīng)體系緩慢滴加溶有N-取代胺(93.6 mmol)的無(wú)水乙醇溶液19.6 mL，滴畢，體系回流反應(yīng)24 h，薄層色譜監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，冷卻，將反應(yīng)體系濃縮，加入40 mL蒸餾水溶解，加入乙醚萃取2次，每次20 mL，合并水層，冰浴下滴加濃鹽酸，調(diào)pH至4～5，析出白色沉淀，抽濾，水洗濾餅，剩余固體用熱異丙醇超聲提取2次，每次30 mL，合并醇層，減壓蒸除溶劑后殘余物以氯仿∶甲醇∶乙酸=15∶1∶0.5(V/V)為洗脫劑經(jīng)硅膠柱層析分離純化，得N-取代氨甲基苯甲酸。

燈盞乙素苷元4'-N，N-取代氨甲基苯甲酸酯(6a～6c)的合成:將N，N-取代氨甲基苯甲酸(95μmol)置25 mL兩口反應(yīng)瓶中，加入0.5 mL二甲基亞砜(DMSO)與5 mL四氫呋喃(THF)攪拌至體系完全澄清，后加入二甲氨基吡啶(DMAP，4 mg，33μmol)與縮酮保護(hù)的燈盞乙素苷元30 mg(67μmol)，攪拌至體系澄清后滴加含有N，N'-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC，17 mg，81μmol)的 3 mL 四氫呋喃溶液，滴畢，室溫?cái)嚢钘l件下反應(yīng)14 h。薄層色譜監(jiān)測(cè)至原料轉(zhuǎn)化完全后，體系減壓濃縮除去四氫呋喃，后用氯仿-水體系萃取3次，洗出體系中二甲基亞砜溶劑，收集氯仿層，無(wú)水硫酸鎂干燥1 h后過(guò)濾，將濾液濃縮，殘余物以氯仿∶甲醇 =30∶1為洗脫劑，硅膠柱層析分離得6，7-二苯縮酮保護(hù)燈盞乙素苷元-4'-氨甲基苯甲酸酯(5a～5c)。在25 mL干燥的茄形瓶中，加入3 mL乙酸乙酯，冰鹽浴(-5℃)攪拌下，依次加入甲醇(0.03 mL，0.7 mmol)、乙酰氯(0.028 mL，0.4 mmol)，保溫反應(yīng)3 h，向反應(yīng)體系中滴加含有6，7-二苯縮酮保護(hù)燈盞乙素苷元-4'-取代氨甲基苯甲酸酯(0.04 mmol)的2 mL乙酸乙酯溶液，保溫反應(yīng)2 h后升至室溫反應(yīng)12 h，有黃色沉淀物附著于壁，加適量乙酸乙酯超聲、洗滌并真空干燥，得到目標(biāo)化合物6a～6c。

2.2 化合物的鑒定

化合物6a:燈盞乙素苷元4'-N-取代對(duì)二乙氨甲基苯甲酸酯。淺黃色固體，產(chǎn)率 52.6% ，mp 為 270-272 ℃ 。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.67(brs， 1H， 5-OH)， 10.67(brs， 1H， 7-OH)，8.68(brs，1H，6-OH)，8.29-8.17(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.89(d，J=8.0 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.53(d，J=8.4 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.97(s， 1H， Ar-H8)， 6.65(s，1H， Ar-H3)， 3.76(s， 2H， Ar″-CH2N)，3.06(m，4H，2 ×NCH2CH3)，1.25-1.23(m，6H，2 ×CH3)。ESI-MS(m/z)[M-H]-:474.2。

化合物6b:燈盞乙素苷元4'-N-取代對(duì)芐氨甲基苯甲酸酯。黃色粉末，產(chǎn)率 46.7% ，mp 為 300℃ (dec.)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.63(brs， 1H， 5-OH)， 10.70(brs， 1H， 7-OH)，8.83(brs，1H，6-OH)，8.28-8.23(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.79(d，J=8.8 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.57-7.55(m，5H，Ph-5H)，7.51(d，J=8.8 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.97(s，1H，Ar-H8)，6.66(s，1H，Ar-H3)，4.29(s，2H，Ar″-CH2N)，4.18(s，2H，CH2Ph)。ESIMS(m/z)[M-H]-:508.5。

化合物6c:燈盞乙素苷元4'-N-取代對(duì)嗎啉甲基苯甲酸酯。黃色粉末，產(chǎn)率 56.4% ，mp 為 300 ℃ (dec.)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:12.63(brs， 1H， 5-OH)， 10.65(brs， 1H， 7-OH)，8.31(brs，1H，6-OH)，8.31-8.17(m，4H，Ar'-H3，5，Ar″-H3，5)，7.83(d，J=7.2 Hz，2H，Ar'-H2，6)，7.52(d，J=8.8 Hz，2H，Ar″-H2，6)，6.98(s， 1H， Ar-H8)， 6.65(s，1H， Ar-H3)， 3.92(s， 2H， Ar″-CH2N)，3.75(m，4H，2 ×CH2O)，2.52(m，4H，2×CH2N)。ESI-MS(m/z)[M-H]-:488.1。

2.3 化合物的藥理活性研究

2.3.1 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞毒性

將PC12細(xì)胞消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，接種于 96孔板(100 μL/孔)，于 37℃和 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁后吸去上清，加入含濃度梯度稀釋藥物(1，10，50，100μmol/L)的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于加藥后24 h，吸去上清液，加入含MTT(0.25 g/L)無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μL二甲基亞砜振蕩使Formazan結(jié)晶溶解，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TC50)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 LDH 漏出率試驗(yàn)

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，以每孔100μL，5×104～10×104個(gè)/mL種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。試驗(yàn)分為正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、加藥組。過(guò)濾培養(yǎng)基后，取細(xì)胞板，小心吸去培養(yǎng)液，換液加藥。正常對(duì)照組每孔加入100 μL的DMEM培養(yǎng)液;模型組每孔加入含有1000μmol/L H2O2的培養(yǎng)液 100 μL，陽(yáng)性對(duì)照組每孔加入含有 1000μmol/L H2O2及20μmol/L維生素 E的培養(yǎng)液 100 μL;加藥組每孔加入含有1000μmol/L H2O2及 1，10，20μmol/L 受試化合物的培養(yǎng)液100 μL，作用PC12細(xì)胞6 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處每孔吸光度值，計(jì)算LDH釋放率。LDH釋放率(%)=上清液LDH/(上清液LDH+裂解液LDH)×100%。每個(gè)質(zhì)量濃度平行3孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，化合物6a，6b，6c都具有明顯的抗氧化作用;與燈盞乙素對(duì)照組比較，化合物6c的抗氧化活性更高。

3 討論

研究中，以燈盞乙素苷元為原料，通過(guò)其與二氯二苯甲烷經(jīng)縮合反應(yīng)，制備6，7-二苯縮酮縮酮保護(hù)燈盞乙素苷元;對(duì)氯甲基苯甲酸與取代胺在無(wú)水乙醇條件下回流反應(yīng)24 h，經(jīng)后處理、純化得N，N-取代氨甲基苯甲酸;以6，7-二苯縮酮縮酮保護(hù)燈盞乙素苷元與N，N-取代氨甲基苯甲酸為反應(yīng)原料，在通用縮合劑N，N'-二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)/二甲基吡啶(DMAP)作用下縮合后，經(jīng)乙酰氯/甲醇體系脫保護(hù)基，獲得目標(biāo)化合物，經(jīng)1H-NMR、ESIMS檢測(cè)，表明合成的化合物與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致;通過(guò)對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用如四甲基偶氮唑鹽比色法、乳酸脫氫酶釋放率的測(cè)定，以維生素E、燈盞乙素以及燈盞乙素苷元作為對(duì)照評(píng)價(jià)設(shè)計(jì)化合物抗氧化活性。

表1 化合物藥理活性研究結(jié)果

N-取代氨甲基苯甲酸制備過(guò)程中，采用了文獻(xiàn)[7]報(bào)道的合成方法，即4-氯甲基苯甲酸與取代胺在無(wú)水乙醇條件下縮合后，體系蒸干后加入4 mol/L NaOH溶液溶解、乙醚萃取除去雜質(zhì)，水層調(diào)酸至產(chǎn)物析出后重結(jié)晶，但從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看目標(biāo)化合物N-取代氨甲基苯甲酸收率極低(＜5%)，而主要得到4-羥甲基苯甲酸。經(jīng)過(guò)改進(jìn)后我們將反應(yīng)體系蒸干溶劑、加水溶解、水層用乙醚洗滌，后用濃鹽酸調(diào)pH至4～5，至沉淀析出后抽濾，水洗濾餅，剩余固體用熱異丙醇超聲提取，提取液蒸除溶劑后，殘余物采用氯仿 ∶甲醇 ∶乙酸(15∶1∶0.5，v/v)為洗脫劑，經(jīng)硅膠柱層析分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物N-取代氨甲基苯甲酸，收率為30～82%。對(duì)新化合物的體外活性，采用了經(jīng)典的過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，遴選出具有明顯活性的新化合物。筆者認(rèn)為，該化合物的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Olanow CW.A radical hypothesis for neurodegeneration[J].Trends Neurosci，1993，16(11):439.

[2]Bennett S，Grant MM，Aldreda S.Oxidative stress in vascular dementia and Alzheimer's disease:a common pathology[J].J Alzheimers Dis，2009，17(2):245.

[3]Hong H，Liu GQ.Protection against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity in PC12 cells by scutellarin[J].Life Sci，2004，74(24):2959.

[4]葛慶華，周 臻，支曉瑾，等.燈盞花素藥物動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2003，34(12):618.

[5]Chen X，Cui L，Duan X，et al.Pharmacokinetics and metabolism of the flavonoid scutellarin in humans after a single oral administration[J].Drug Metab Dispos，2006，34(8):1345.

[6]車(chē)慶明，潘麗怡，陳 穎，等.燈盞花乙素苷元的藥動(dòng)學(xué)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(18):1418.

[7]Lombardino JG.[4-Substituted benzoyloxy]-N-substituted2H-1，2benzothiazine-3-carboxamide1，1-dioxdes having antiarthritic activity[J].U.S.Patent，4，623，486(1986).