劉清新 ，于永軍 ，焦 艷 ，潘海霞

1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州 061001；2.滄州市藥檢所，河北滄州 061001

清熱醒腦靈片由水牛角、黃芩、黃連、冰片、梔子等十三味藥組成，具有清熱解毒，開(kāi)竅醒腦，息風(fēng)安神之效，可用于腦炎、高血壓及各種高熱的治療[1]，并收載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊(cè)，于1993年頒布執(zhí)行。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微法鑒別、化學(xué)法鑒別及常規(guī)檢查，未對(duì)任何藥物或有效成分進(jìn)行含量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)清熱醒腦靈片處方中梔子所含的主要成分梔子苷進(jìn)行含量測(cè)定，為該制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，保障臨床用藥的安全有效。

1 儀器與試藥

Agilent1100型高效液相色譜儀 （G1315B型DAD檢測(cè)器，G1311A型泵，G1311A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱），Hypersil ODS2 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；BS124S型電子分析天平；KH-3200DB型超聲波清洗儀。

梔子苷對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110749-200714，供含量測(cè)定用），乙腈為色譜純（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），清熱醒腦靈片（河北天成藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20090212、20090310、20090320），陰性樣品為自制；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hypersil ODS2 C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：20℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 238 nm；流動(dòng)相：乙腈-水（15∶85）[2-3]；理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇制成300 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋制成30 μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于1片重量），置25 ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含梔子的陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 空白干擾試驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、2、5、8、10、15 ml，分別置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以梔子苷濃度C為橫坐標(biāo)，以峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見(jiàn)圖2。

圖1 空白干擾試驗(yàn)色譜圖

由圖1可知，其他原輔料對(duì)梔子苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。

圖2 線性關(guān)系試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，梔子苷溶液在6.36～95.40 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=24.62C+19.77（r=0.9999，n=6）。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，各峰面積的RSD值為0.42%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取批號(hào)為20090212的樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件分別測(cè)定含量，共測(cè)定5份。結(jié)果顯示，其平均含量為0.500 mg/片，RSD為0.67%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在 20℃條件下，分別于 0、1、2、4、8 h，精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定梔子苷峰面積。結(jié)果顯示，各峰面積的RSD值為0.83%，表明供試品溶液在20℃條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn)

按2片重量的80%、100%、120%稱取供試品細(xì)粉，每一濃度稱取3份樣品，加甲醇25 ml，超聲處理30 min，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5 ml，精密加入梔子苷對(duì)照品溶液5 ml，混勻，作為供試溶液。分別取上述供試品溶液和梔子苷對(duì)照品溶液，按照含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定。見(jiàn)表1。

表1 梔子苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果可知，本法梔子苷回收率較好。

2.9 樣品含量測(cè)定

取本品樣品3批，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件分別測(cè)定含量。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取濃度為30 μg/ml的梔子苷對(duì)照品甲醇溶液，采用分光光度法在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果本品在237.5 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參照梔子含量測(cè)定項(xiàng)下方法[2]及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，確定梔子苷含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm。

3.2 超聲提取時(shí)間的選擇

參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，在制備供試品溶液時(shí)，取同一批號(hào)樣品，以甲醇為溶劑超聲提取 10、20、30、40 min，在同一色譜系統(tǒng)及色譜條件下試驗(yàn)，結(jié)果各樣品的平均含量分別為0.435、0.449、0.494、0.496 mg/片，表明 30 min 時(shí)梔子苷基本提取完全，故確定超聲提取時(shí)間為30 min。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的清熱醒腦靈片中梔子苷的HPLC含量測(cè)定方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，本法專屬性好，靈敏度高，穩(wěn)定性及重復(fù)性均符合含量測(cè)定要求，且操作簡(jiǎn)便，可以作為清熱醒腦靈片的一個(gè)質(zhì)量控制方法。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].中藥成方制劑:第8冊(cè),1993:175.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:173.

[3]劉寧.HPLC法測(cè)定解郁安神片中梔子苷的含量[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2008,9(6):467-469.

[4]邵燕虹,宋麗莉,周燕雙.HPLC法測(cè)定清熱暗瘡?fù)柚袟d子苷的含量[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(22):3518-3519.

[5]張大軍,王兆華.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)腎寧片中梔子苷的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(12):88-89.

[6]黃曉丹,傅英,陳禧翎,等.HPLC法測(cè)定清開(kāi)靈膠囊中梔子苷的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2009,16(6):52-53.