劉 濤 ，李建瑞 ，嚴江偉 ，李玲香 ，王利偉 ，

1.北京市垂楊柳醫(yī)院耳鼻咽喉科，北京 100022；2.中國科學(xué)院北京基因組研究所，北京 100029；3.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010059

耳聾是最常見的殘疾之一，其發(fā)病率高、病因復(fù)雜、治療困難，給個人、家庭及社會帶來巨大的壓力和沉重的負擔(dān)。據(jù)各國統(tǒng)計，每1000名新生兒中，有1～3例聽力障礙兒童，其中至少一半與遺傳因素有關(guān)。研究表明，線粒體（mtDNA）12SrRNA基因A1555G點突變能引起氨基糖苷類藥物敏感性耳聾（aminoglycoside antibiotics induced deafness，AAID）[1]，占遺傳性聾1%～2%[2]。目前國內(nèi)用于檢測線粒體 12S rRNA基因第1555位A＞G均質(zhì)性突變的方法為：PCR擴增線粒體DNA片段，限制性內(nèi)切酶分析（RFLP）和 DNA序列分析[3]。本文采用常規(guī)流行病學(xué)的研究方法結(jié)合分子生物學(xué)的手段，于2006年7月～2010年10月對內(nèi)蒙古鄂爾多斯市特殊教育學(xué)校102名非綜合征型感音神經(jīng)性耳聾患者的mtDNA A1555G點突變進行檢測，以了解耳聾和該突變的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇內(nèi)蒙古鄂爾多斯市特殊教育學(xué)校學(xué)生102例。這些學(xué)生從內(nèi)蒙古鄂爾多斯市下屬的各個旗、縣招生。其中，男56例，女46例；年齡6～23歲，平均15.65歲；蒙古族10例，漢族92例。

1.2 方法

1.2.1 病史資料采集 首先，通過學(xué)校給家長或監(jiān)護人發(fā)放知情同意書；然后由學(xué)生和家長共同填寫調(diào)查問卷。問卷包括患者的一般情況，如姓名、性別、出生年月；特別要關(guān)注患者的耳聾病史、家族中是否有同樣的耳聾患者、是否用過耳毒性藥物、耳聾是否與外傷有關(guān)、是否患過腮腺炎等可以引起耳聾的傳染病疾病史。對患者的耳鼻喉科進行正規(guī)的?？茩z查和聽力學(xué)評估。對所有患者行純音測聽和聲導(dǎo)抗檢查。在學(xué)校對所有患者抽取外周靜脈血3 ml，低溫冷凍保存。在實驗室進行全基因組DNA的提取，然后進行A1555G點突變的篩查。

1.2.2 基因組DNA的制備 用DNA提取試劑盒（QIA amp DNA Blood Mini Kit 250）提取耳聾患者的全基因組DNA，取適量用紫外分光光度計進行純度檢測，將提取的DNA置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計與合成 用Primer 3 input數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。正向引物序列：5'-CCGCCATCTTCAGCAAACCCTG-3'；反向引物序列：5'-TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG-3'。

1.2.4 PCR擴增 PCR反應(yīng)體系包括1×PCR緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 mol/L 正反向引物、40 ng 基因組DNA、1U TaqDNA聚合酶（PCR反應(yīng)試劑均為北京Fermentas公司產(chǎn)品），去離子滅菌水補足至20 μl。PCR反應(yīng)在 DNA熱循環(huán)儀（BIO RAD PTC-200，美國BIO RAD公司）上進行。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，經(jīng) 30個循環(huán)，最后 72℃延伸 10 min。4℃保存。PCR產(chǎn)物 4 μl與1 μl溴酚藍混合，1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，40 min），DL2000 DNA Ladder（北京天根公司）標記，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下進行PCR產(chǎn)物鑒定。

1.2.5 限制性內(nèi)切酶分析 酶切總體系30 μl，針對mtDNA 12SrRNA的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后取10 μl，加入Alw26I（酶切位點：5'-GAGAC）限制性內(nèi)切酶（北京 Fermentas公司）1 μl，Buffer Tango 緩沖液 2 μl，去離子滅菌水補足至30 μl。酶切條件：37℃水浴箱中溫育消化過夜，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證，酶切切開者為150 bp和295 bp兩個條帶，為突變陰性；如只見445 bp的一個條帶，說明存在mtDNA A1555G突變；均設(shè)陽性和陰性對照。不能切開的或是酶切顯示不清的送測序驗證。

1.2.6 DNA序列測定 擴增出的PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAGEN PCR純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物經(jīng)電泳證實后，再做Cycle Sequencing反應(yīng)。用擴增模扳的引物行測序反應(yīng)，然后在3100毛細管測序儀上該片段進行DNA序列測定。取DNA庫內(nèi)正常人混合基因組DNA做正、反向測序，作為單鏈DNA測序的陽性對照。 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性 10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，循環(huán)25次。反應(yīng)產(chǎn)物用Gentri-Sep Spin columns除去過量的dye terminators保證反應(yīng)產(chǎn)物適合在3100毛細管測序儀內(nèi)進行。測序結(jié)果經(jīng)過3100測序分析系統(tǒng)軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 病史資料

聾啞學(xué)校的102例非綜合征型耳聾患者中，三代人中可發(fā)現(xiàn)2例耳聾患者的有11例，1例是父母近親結(jié)婚，其余均為散發(fā)性耳聾。

2.2 聽力損失評估

極重度聾占大多數(shù)，共89例，其次是重度聾，共10例，中度聾和中重度聾3例。聲導(dǎo)抗測試：鼓室壓圖：大多數(shù)為A型鼓室曲線共58例；其次是As型鼓室曲線共30例；B型鼓室曲線共13例；Ad型鼓室曲線僅有1例。鐙骨肌反射：57例雙耳都沒有引出鐙骨肌反射，31例可引出鐙骨肌反射者，但反應(yīng)閾較高，另外14例聽力較好耳可引出鐙骨肌反射。1.5歲以下發(fā)現(xiàn)耳聾82例，1.5～5.0歲發(fā)現(xiàn)耳聾20例。

2.3 藥物性耳聾情況

用氨基糖苷類抗生素后發(fā)現(xiàn)耳聾54例。其中以使用慶大霉素最多見為33例，其次是鏈霉素共13例?？敲顾嘏c上述二種藥物聯(lián)合使用2例。三種藥物兩兩聯(lián)合使用5例，三種聯(lián)合使用1例。因感冒發(fā)熱使用48例，其他病因使用6例。

2.4 線粒體A1555G基因突變酶切結(jié)果

本實驗擴增的片段是從線粒體基因核苷酸1261到1705，PCR產(chǎn)物共有445 bp。含有GAGAC核苷酸序列的DNA片段可被限制性內(nèi)切酶Alw26I識別。如果發(fā)生突變，這個識別位點消失，PCR產(chǎn)物不被酶切，經(jīng)該酶孵育過的電泳檢測仍為445 bp一條帶；如果未發(fā)生突變，擴增產(chǎn)物被酶切后就被分為295 bp和150 bp兩個片段。7例患者的PCR產(chǎn)物經(jīng)Alw26I酶切后無識別位點的丟失，電泳檢測為一條445 bp的帶，陽性率是6.9%（7/102），有氨基糖苷類用藥史54例，該點突變的發(fā)生率為13.0%（7/54）。部分病例酶切結(jié)果見圖1。

圖1 部分病例酶切結(jié)果

2.5 mtDNA 12SrRNA A1555G基因測序結(jié)果

7例存在線粒體基因A1555G位點突變，與酶切結(jié)果相吻合。見圖2。

3 討論

人類線粒體是一個雙鏈閉環(huán)分子，由16569 bp的核苷酸序列組成。與其他細胞器諸如溶酶體和過氧化物酶等特化膜結(jié)構(gòu)相比，線粒體具有自己的遺傳物質(zhì)，因而是一種半自主復(fù)制體。這是指mtDNA能夠獨立地復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯[4-5]。當(dāng)mtDNA出現(xiàn)突變時，核苷酸序列和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致mtDNA亞單位rRNA的結(jié)構(gòu)與細菌蛋白核糖體的結(jié)構(gòu)極為相似，改變了結(jié)構(gòu)的rRNA與氨基糖苷類抗生素有極高的親和力。而野生型rRNA卻不能與氨基糖苷結(jié)合[6]。這是氨基糖苷類抗生素致聾的的機制之一。

在臨床工作中，有的患者由于患有結(jié)核病等原因，使用氨基糖苷類抗生素可達3個月之久，卻沒有發(fā)生聽力下降；有些患者僅用了少量的氨基糖苷類抗生素，結(jié)果發(fā)生了極為嚴重的聽力下降而導(dǎo)致聾啞癥?？梢妭€體對氨基糖苷類抗生素的敏感性有巨大的差異性，這是由基因決定的。本研究資料也說明，該地區(qū)有明顯的抗生素濫用傾向，只要有發(fā)熱就使用氨基糖苷類抗生素。因此，停止濫用抗生素對降低耳聾的發(fā)生也是非常有效的方法之一。由于本研究有7例患者存在mtDNA A1555G點突變，全部有氨基糖苷類抗生素用藥史，說明mtDNA A1555G點突變是他們患病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。但是，另外的47例卻沒有檢測到該位點的的突變，不能排除mtDNA其他位點的突變；如線粒體A7445G點突變，C1494T等的點突變[2-7]。也不能排除核基因的調(diào)控和環(huán)境因素的影響。賈婧杰等[8]對山東省濱州市特教學(xué)校74例耳聾學(xué)生進行了12S rRNA基因A1555G點突變的檢測，5例為陽性，陽性率為6.76%（5/74）與本文結(jié)果一致。該群體線粒體A1555G位點的突變率高于以往的報道，攜帶有該突變的個體對氨基糖苷類抗生素有高度易感性，因此該基因突變是感音神經(jīng)性耳聾的原因之一。鮑曉林等[9]對西北地區(qū)245例患者行A1555G點突變檢測，86例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史，檢測到21例線粒體DNA 12SrRNA A1555G同質(zhì)型突變，突變檢出率為24.4%（21/86）；在東北地區(qū)188例患者中，66例有氨基糖苷類藥物應(yīng)用史，檢測到2例同質(zhì)型突變，1例異質(zhì)性突變，突變檢出率為4.5%（3/66）。兩地區(qū)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，西北地區(qū)線粒體DNA 12SrRNA A1555G突變檢出率顯著高于東北地區(qū)。

由于本次研究只針對內(nèi)蒙古鄂爾多斯聾啞學(xué)校學(xué)生進行檢測，這些學(xué)生大多為重度-極重度非綜合征型耳聾患者，而本文只檢測了mtDNA A1555G突變，還應(yīng)有該基因其他位點的突變。所以內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)的線粒體基因突變的頻率應(yīng)該高于單個點突變6.9%的比率。這一地區(qū)mtDNA高突變率的遺傳學(xué)因素，氨基糖苷類藥物的高使用率是這一地區(qū)高聾啞癥發(fā)生率的原因。因此，氨基糖苷類抗生素的使用應(yīng)該非常慎重，對非用不可的患者要仔細詢問其耳聾家族史，進行mtDNA A1555G點突變的檢測，對該位點陰性的個體先行常見其他位點的檢測，必要時行全部基因組mtDNA的檢測。如果有mtDNA的點突變則避免使用氨基糖苷類抗生素，防止人為因素造成的聽力損害。這對防聾將產(chǎn)生重大而深遠的意義。

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