黃玉柳，黃國(guó)秋，葉欣宇，黎小正，吳祥慶，楊姝麗，吳明媛

(廣西水產(chǎn)研究所，廣西 南寧 530021)

腹瀉性貝類(lèi)毒素(Diarrhetic shellfish poisons，DSP)是由有毒赤潮藻類(lèi)鰭藻屬和原甲藻屬中部分藻種產(chǎn)生的一類(lèi)脂溶性天然化合物，主要成分為軟海綿酸及其衍生物。有毒藻經(jīng)雙殼貝類(lèi)濾食后，其毒素會(huì)在貝體內(nèi)累積，導(dǎo)致貝類(lèi)食用者中毒，出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等癥狀。

目前，用于DSP檢測(cè)的方法主要有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法、細(xì)胞毒性測(cè)試法、酶活力抑制分析法、高效液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[1，2]。食品檢驗(yàn)部門(mén)常用小鼠生物法進(jìn)行DSP檢驗(yàn)，但由于該方法對(duì)小鼠品種(品系)的要求較高，毒素提取過(guò)程復(fù)雜，易受雜質(zhì)干擾，且變異性較高，因而檢測(cè)的準(zhǔn)確性和專(zhuān)一性較差，不利于調(diào)查追蹤污染源以及對(duì)染毒貝類(lèi)進(jìn)行早期臨控和預(yù)警。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是利用抗體和抗原的特異性結(jié)合反應(yīng)建立的免疫化學(xué)方法，其靈敏度高、成本低、特異性強(qiáng)、儀器要求不高、樣品前處理簡(jiǎn)單，特別適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)和大量樣本快速篩查，近年來(lái)在分析化學(xué)領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。作者在此介紹了美國(guó)ABRAXIS腹瀉性貝類(lèi)毒素試劑盒的測(cè)定方法，并和傳統(tǒng)的小鼠生物法進(jìn)行了比較。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品來(lái)源

分別于廣西欽州和防城港海域近江牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)采集近江牡蠣樣品20個(gè)，于北海海域文蛤養(yǎng)殖場(chǎng)采集文蛤樣品20個(gè)，共60個(gè)樣品。樣品采集后立即置于冰排中存放，當(dāng)日送回實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

美國(guó)ABRAXIS腹瀉性貝類(lèi)毒素試劑盒，甲醇。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

酶標(biāo)比色儀 (BIO-TEK)，離心機(jī)，均質(zhì)器。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

試劑盒中提供的DSP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb。結(jié)果分析可采用商業(yè)ELISA分析軟件(4-Parameters，Logit/Log)或手工計(jì)算。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的B/B0為縱坐標(biāo)(B和B0分別為各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度、零標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度)、岡田酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.2 樣品前處理

首先除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)。稱(chēng)取1 g 均質(zhì)后的樣品加入6 mL80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；加2 mL 80%甲醇到殘留貝肉組織中，再次3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；重復(fù)以上步驟，待收集的上清液達(dá)到10 mL時(shí)，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾；取10 μL濾液，用緩沖溶液稀釋到1 mL。

1.3.3 試劑盒的測(cè)定程序

依次在預(yù)包被抗體的微孔板中加入濃度分別為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb的DSP標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品提取液各100 μL。每個(gè)測(cè)試孔加入50 μL岡田酸酶標(biāo)記物溶液、50 μL岡田酸抗體溶液，用封口膜蓋上微孔板，輕輕振蕩微孔板30 s，使液體混勻。室溫下孵育60 min。孵育完成后，取掉封口膜，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL 1X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。每個(gè)測(cè)試孔加入150 μL顯色液(底物)。室溫避光孵育20～30 min。每個(gè)測(cè)試孔加入100 μL反應(yīng)終止液。用酶標(biāo)測(cè)定儀在450 nm處測(cè)量吸光度值。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中DSP的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 方法靈敏度和檢測(cè)限

本方法靈敏度為1.7 ppb。根據(jù)樣品處理稀釋系數(shù)，檢測(cè)限為0.1 ppb。

2.3 樣品檢測(cè)

樣品檢測(cè)結(jié)果表明，欽州近江牡蠣DSP平均含量為21 ppb；防城港近江牡蠣DSP平均含量為34 ppb；北海文蛤DSP平均含量為23 ppb。

2.4 ELISA法和小鼠生物法檢測(cè)DSP的比較(表1)

表1 ELISA法和小鼠生物法的比較

從表1可以看出，ELISA法檢測(cè)限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于小鼠生物法，日常管理中可通過(guò)ELISA法快速檢測(cè)篩查，更加及時(shí)地向管理部門(mén)提供食品風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警信息，有效地控制赤潮毒素造成的影響，減少損失，避免由此帶來(lái)的食品衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，在檢出可能染毒的貝類(lèi)時(shí)，及時(shí)將貝類(lèi)轉(zhuǎn)移到清潔水體中進(jìn)行一定時(shí)間的凈化，使其體內(nèi)的毒素含量降低到可以食用的水平。

3 結(jié)論

采用美國(guó)ABRAXIS腹瀉性貝類(lèi)毒素(DSP)試劑盒對(duì)廣西欽州和防城港海域近江牡蠣各20個(gè)樣品、北海海域文蛤20個(gè)樣品進(jìn)行了DSP檢測(cè)。全部檢測(cè)過(guò)程在2 h內(nèi)完成，檢測(cè)限為0.1 ppb，靈敏度為1.7 ppb。ELISA法檢測(cè)操作方便、成本低，檢測(cè)限和靈敏度均滿(mǎn)足要求，非常適于快速檢測(cè)，有望作為理想的DSP篩選分析方法之一，在水產(chǎn)品質(zhì)量快速檢測(cè)、養(yǎng)殖區(qū)染毒情況調(diào)查以及上市貝類(lèi)質(zhì)量監(jiān)控方面發(fā)揮重要作用。

[1] 曹際娟，衛(wèi)鋒，馬惠蕊，等.貝類(lèi)毒素檢測(cè)技術(shù)及研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14(1)：53-56.

[2] 葛虹.貝類(lèi)毒素的檢測(cè)[J].漁業(yè)致富指南，2008，(12)：36-37.