陳 莉，孫紹發(fā),宋功武

(1.咸寧學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一類最重要的生物大分子，藥物進(jìn)入人體后需要通過血漿的儲運才能發(fā)生藥理作用。因此，研究以血清白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與生物活性小分子間的相互作用，有助于認(rèn)識藥物的作用機制，了解藥物在體內(nèi)的運輸、分布，也有助于對藥物的藥效和不良反應(yīng)進(jìn)行評估，具有重要的理論指導(dǎo)意義。

吡喃并噻吩并嘧啶酮衍生物是一類具有良好生物活性的雜環(huán)化合物，如抗菌、抗病毒[1，2]、抑制肥胖[3，4]、消炎鎮(zhèn)痛[5]、抗焦慮以及抗心律不齊[6]等。

作者采用熒光光譜法研究了不同溫度下3-對氯苯基-2-(四氫吡咯-1-基)-5，6，8-三氫吡喃并[3′，4′：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮(PPTP)(圖1) 與牛血清白蛋白(BSA) 的相互作用，計算了二者之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)，確定了作用力類型，并采用同步熒光技術(shù)考察了PPTP對BSA構(gòu)象的影響。

圖1 PPTP的結(jié)構(gòu)

1 實驗

1.1 試劑與儀器

PPTP，自制[7]:m.p.234～235 ℃。IR(KBr)，ν，cm-1：3054(=CH)，1687(C=O)，1582(C=C)，1521(C=N)，1492、1458(C=C)，1221(C-N)，1089(C-O-C)。1HNMR(300 MHz，CDCl3)，δ，ppm:1.73(s，4H，2CH2)，2.98(s，2H，CH2)，3.06(t，4H，2CH2)，3.96(t，2H，CH2)，4.73(s，2H，CH2)，7.26～7.45(m，4H，C6H4)。MS:m/z，%：387(100，[M+])，358(24)，287(17)，165(34)，111(24)，70(32)。

牛血清白蛋白(BSA，中國科學(xué)院化學(xué)研究所)，BSA溶解在Tris-HCl(0.05 mol·L-1Tris+0.10 mol·L-1NaCl，pH=7.4) 緩沖溶液中，其它試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

F-4500型熒光分光光度計(帶恒溫系統(tǒng))、UV-2300型紫外可見分光光度計，日本日立；PHS-3C型pH計，江蘇江分；BS124S型電子分析天平，北京賽多利斯。

1.2 方法

分別配制5.0×10-3mol·L-1的PPTP貯備液(DMF為溶劑)及不同溫度(T=298 K、302 K、306 K、310 K)下pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液。

在1 cm比色皿中分別加入2 mL 1×10-5mo1·L-1的BSA溶液和不同量的PPTP，得到不同物質(zhì)的量比的PPTP與BSA系列溶液。在λ=282 nm下激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，繪制系列溶液在不同溫度下300～500 nm 的熒光光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

由于蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光，當(dāng)激發(fā)波長為282 nm時，BSA在366 nm附近有熒光發(fā)射峰。而以同樣激發(fā)波長激發(fā)各濃度PPTP溶液，在366 nm附近則沒有熒光，證明在366 nm附近PPTP不會產(chǎn)生與BSA相互干擾的熒光。圖2為PPTP對BSA熒光猝滅光譜。

c(BSA)=1×10-5mol·L-1;A→J，PPTP(×10-5mol·L-1):0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5

由圖2可知，隨著PPTP濃度的增大，BSA 的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅，且發(fā)射波長略有紅移。

2.2 猝滅機理

BSA熒光猝滅的原因通常有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)之間有能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，生成瞬時的激發(fā)態(tài)復(fù)合物而引起的猝滅。動態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大，其過程遵循Stern-Volmer方程[8]。

(1)

式中：F、F0分別是有、無猝滅劑時的熒光強度；Kq是雙分子猝滅過程速率常數(shù)；KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)；τ0是無猝滅劑時生物大分子的平均壽命(生物大分子的平均壽命約為10-8s)；cq為猝滅劑濃度。而KSV=Kqτ0，故可由猝滅曲線斜率求得猝滅常數(shù)。通常各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1。

根據(jù)Stern-Volmer 方程，作不同溫度下(T=298 K、302 K、306 K和310 K)的[(F0/F)-1]～cq關(guān)系圖，如圖3所示。

圖3 不同溫度下，[(F0/F)-1]～cq關(guān)系

由圖3得到298 K、302 K、306 K和310 K時的猝滅速率常數(shù)Kq分別為3.631×1012L·mol-1·s-1、3.154×1012L·mol-1·s-1、2.899×1012L·mol-1·s-1、2.565×1012L·mol-1·s-1。顯然，4個溫度下的猝滅速率常數(shù)Kq都遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，且隨著溫度的升高，Kq值減小。表明形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅是引起B(yǎng)SA溶液體系熒光猝滅的主要原因。

2.3 作用力類型

運用公式Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系(式2)[9]探討PPTP與BSA的靜態(tài)猝滅作用：

(2)

式中:KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù)，用于描述靜態(tài)猝滅過程中生物大分子與猝滅劑的結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時的量效關(guān)系。

表1 不同溫度下PPTP與BSA結(jié)合的Lineweaver-Burk常數(shù)、相應(yīng)直線關(guān)系

根據(jù)Van′t Hoff方程，在溫度變化不大時可以近似認(rèn)為ΔHθ為一常數(shù)，由結(jié)合常數(shù)KLB，求得ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ，見表2。

表2 不同溫度下，PPTP與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

活性小分子與生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔHθ和熵變ΔSθ的相對大小，可以判斷活性小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型[9]：ΔHθ>0、ΔSθ>0為疏水作用力；ΔHθ<0、ΔSθ<0為氫鍵和范德華力；ΔHθ≈0、ΔSθ>0為靜電引力。

從表2可以看出，PPTP與BSA的相互作用是自發(fā)的(ΔGθ<0)；ΔHθ>0、ΔSθ>0，可以認(rèn)為，PPTP與BSA之間的作用力主要是熵增加驅(qū)動的疏水作用力。

2.4 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)

靜態(tài)猝滅過程中，靜態(tài)猝滅熒光強度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光-猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式導(dǎo)出[10]：

(3)

式中:Ka為猝滅劑與BSA之間的結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點數(shù)。

表3 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)

由表3可知，不同溫度下、pH值為7.4時，PPTP與BSA的結(jié)合位點數(shù)n均接近1，Ka大于10 000 L·mol-1，說明PPTP與BSA兩者間有較強結(jié)合作用，且形成一個結(jié)合位點。

2.5 PPTP對BSA 構(gòu)象的影響

Δλex=15 nm所得同步熒光光譜反映酪氨酸殘基的光譜特性；而Δλex=60 nm所得同步熒光光譜反映色氨酸殘基的光譜特性。采用同步熒光技術(shù)，固定BSA的濃度，逐漸增加PPTP的濃度，記錄Δλex=15 nm 和Δλex=60 nm 時的同步熒光光譜，結(jié)果見圖4。

c(BSA)=1.0×10-5mol·L-1；A→J，PPTP(×10-5mol·L-1)：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5

由圖4可以看出，酪氨酸殘基同步熒光光譜(Δλex=15 nm)的最大發(fā)射波長基本不變，色氨酸殘基同步熒光光譜(Δλex=60 nm)的最大發(fā)射波長紅移，表明PPTP與BSA發(fā)生相互作用后，導(dǎo)致色氨酸近鄰區(qū)域環(huán)境的極性增大，使得處于BSA中疏水區(qū)域的色氨酸殘基更多地暴露于介質(zhì)溶液的親水區(qū)，這與熒光光譜的分析結(jié)果一致。另外，BSA色氨酸殘基所處周圍環(huán)境由于小分子的插入引起局部構(gòu)象改變，也可能導(dǎo)致BSA構(gòu)象的變化。

3 結(jié)論

采用熒光光譜法，研究了不同溫度下、pH值為7.4時，3-對氯苯基-2-(四氫吡咯-1-基)-5，6，8-三氫吡喃并[3′，4′：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮(PPTP)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。結(jié)果表明，PPTP主要以靜態(tài)猝滅方式使BSA熒光強度顯著降低；PPTP與BSA之間的作用力主要為疏水作用力；PPTP與BSA之間有較強結(jié)合作用，且形成一個結(jié)合位點；PPTP與BSA發(fā)生相互作用后，導(dǎo)致色氨酸近鄰區(qū)域環(huán)境的極性增大，使得處于BSA中疏水區(qū)域的色氨酸殘基更多地暴露于介質(zhì)溶液的親水區(qū)，BSA色氨酸殘基所處周圍環(huán)境由于小分子的插入引起局部構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致了BSA構(gòu)象的變化。

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