肖貴南，孫清萍，盛英美

廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180

新藥以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法代替既往的家兔熱原檢查法是一個(gè)趨勢，在藥害事件的應(yīng)急處理中有一定的應(yīng)用價(jià)值，這也符合國際上對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則（優(yōu)化、減少、替代）的要求。現(xiàn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法是1968年美國科學(xué)家Levin和Bang所建立的鱟試驗(yàn)法[1]。從開展內(nèi)毒素檢查的現(xiàn)狀來看，部分單位未能參照《中國藥典》2010年版二部的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和設(shè)計(jì)，本文著重介紹在建立新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中容易出現(xiàn)問題的細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定及干擾試驗(yàn)這兩個(gè)環(huán)節(jié)，力圖為新藥的質(zhì)量控制以及應(yīng)急檢驗(yàn)提供有益的參考依據(jù)。

1 新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的確認(rèn)

1.1 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的計(jì)算公式

新藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值（L）的確定是整個(gè)方法學(xué)建立的前提和基礎(chǔ)，現(xiàn)在一般按照《中國藥典》2010版二部附錄XI E進(jìn)行確定[2]。計(jì)算公式為L=K/M，K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/（kg·h）表示，非放射性注射劑 K=5 EU/（kg·h），放射性注射劑 K=2.5 EU/（kg·h），鞘內(nèi)用注射劑K=0.2 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，成人體重按60 kg計(jì)算，體表面積為1.62 m2。部分抗腫瘤藥物及抗生素的使用劑量以體表面積描述時(shí)，可將每平方米體表面積劑量乘以0.027，即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量。

1.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值的確認(rèn)程序

首先根據(jù)所研究的新藥品種說明書，通過查閱最新版《臨床用藥須知》等相關(guān)權(quán)威資料，得到人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量（M值）并求出L值，將所求得的L值與相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（《美國藥典》、《英國藥典》、《日本藥局方》、《歐洲藥典》）以及國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)或注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)散件中關(guān)于該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素限值進(jìn)行參考對(duì)比。

還有一種方法是參考該品種的熱原檢查劑量（可視為M值），因?yàn)闊嵩瓌┝康脑O(shè)置一般為成人臨床用量的1～3倍，與常用的安全系數(shù)3～10倍較為接近，這種參考熱原檢查劑量的做法在以前頗為盛行，現(xiàn)在已逐漸少用。

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素限值計(jì)算的常見誤區(qū)

1.3.1 將成人日均用量誤作最大用量 大多數(shù)情況下，說明書或資料往往只提供了某藥的單次或每日用量，實(shí)踐中不少人往往將單次用量誤作最大用量進(jìn)行限值計(jì)算，所得限值明顯偏寬。眾所周知，除極少數(shù)情況（急性、重癥患者用藥）下的單次用量可作為最大用量外，多數(shù)情況的日常用量換算成最大用量，還需考慮一定的安全系數(shù)（一般取3～10倍）。

1.3.2 誤將每日總用量當(dāng)成每次最大用量 只根據(jù)說明書或資料提供的某藥的每日總用量，未考慮該藥品總量的靜脈滴注時(shí)間已經(jīng)遠(yuǎn)不止1 h，這樣求得的限值難于真實(shí)反映實(shí)際限值，因?yàn)镸值是反映人用每千克體重每小時(shí)能接受的最大供試品劑量，而非全日的總用量。

1.3.3 對(duì)于大輸液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定過于按部就班 沒有考慮大輸液的特殊要求，大輸液的主藥成分只占其中很少的一部分，實(shí)際多為葡萄糖注射液或生理鹽水注射液，如果按主藥成分計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素限值的話，容易偏寬，因而如無特殊情況一般將熱原檢查劑量10 ml/kg視為最大臨床用量，將大輸液細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為0.5 EU/ml。

1.3.4 忽視滴注時(shí)帶入的外源性細(xì)菌內(nèi)毒素 某些新藥在臨床使用時(shí)是溶于大輸液進(jìn)行滴注的。假設(shè)某抗生素藥品的規(guī)格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h內(nèi)滴注完畢。可參照下述方法計(jì)算該抗生素細(xì)菌內(nèi)毒素限值，此時(shí) K=5 EU/（kg·h），因而 60 kg 的成人每小時(shí)體內(nèi)可以接受細(xì)菌內(nèi)毒素的最大量為300 EU，而在1 h內(nèi)250 ml的5%葡萄糖注射液最大可帶來125 EU的細(xì)菌內(nèi)毒素，1 g的該藥最多只能帶入175 EU（125～300 EU）的細(xì)菌內(nèi)毒素，因而該抗生素其細(xì)菌內(nèi)毒素限值可定為0.175 EU/mg。如果按常規(guī)計(jì)算的話，求得限值為0.300 EU/mg。

1.3.5 沒有考慮到主藥外的其他成分 在細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定過程中，特別是原料，要注意扣除主藥外的其他成分（如金屬離子：頭孢噻肟鈉中的鈉，西司他丁鈉中的鈉），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)一般規(guī)定為每毫克中頭孢噻肟或西司他丁所含的細(xì)菌內(nèi)毒素量不得過多少EU，而制成的原料往往是含鈉等其他成分的。

2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

2.1 前期準(zhǔn)備工作

試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無干擾的器械。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法（如強(qiáng)酸強(qiáng)堿浸泡法），但需經(jīng)過確證不干擾鱟試驗(yàn)檢查。

2.2 靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。需要注意的是，當(dāng)實(shí)測靈敏度 λc 在 0.5λ～2.0λ（包括 0.5λ～2.0λ，λ為鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度，日常檢驗(yàn)中部分檢驗(yàn)者誤將實(shí)測的靈敏度作為批鱟試劑的靈敏度來進(jìn)行常規(guī)檢查或干擾試驗(yàn)。

3 鱟試驗(yàn)檢查的干擾試驗(yàn)

3.1 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確認(rèn)

MVD是指在試驗(yàn)中供試品溶液被允許達(dá)到稀釋的最大倍數(shù)，計(jì)算公式為MVD=C·L/λ，式中L為供試品的內(nèi)毒素限值，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度；C為供試品液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，則C等于1.0；如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度C=λ/L。

此處往往根據(jù)市售主要的鱟試劑靈敏度范圍（0.03～1.00 EU/ml）來計(jì)算干擾試驗(yàn)中的有效濃度稀釋范圍。

3.2 干擾預(yù)試驗(yàn)

取本品1支（原料精密稱取不低于10 mg的量），按照擬定內(nèi)毒素限值，原料或注射用粉針加內(nèi)毒素檢查用水溶解并稀釋至不超過MVD規(guī)定的系列濃度，注射液直接稀釋至不超過最小有效稀釋濃度的系列濃度，預(yù)試驗(yàn)時(shí)一般可取一個(gè)廠家靈敏度為0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鱟試劑，對(duì)供試品原液及其系列稀釋液（供試品陰性對(duì)照，NPC）進(jìn)行干擾檢驗(yàn)，另外設(shè)立陽性對(duì)照（PC）、陰性對(duì)照（NC）、供試品陽性對(duì)照（PPC），每個(gè)濃度平行做兩管，最終得出供試品（批號(hào)：20100802）在某濃度及以下濃度對(duì)鱟試驗(yàn)檢查不產(chǎn)生干擾作用（PPC首次出現(xiàn)“++”的濃度）的結(jié)論。供試液的干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，見表1。

由表1可以看出，供試品在不高于20 mg/ml的濃度下不干擾鱟試驗(yàn)的檢查。

表1 供試品溶液干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

3.3 正式干擾試驗(yàn)

按表2制備各系列溶液，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過MVD的溶液，參照鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作，記錄供試液的干擾情況。

表2 凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備

只有當(dāng)供試品溶液和陰性對(duì)照溶液的平行管都為陰性，且鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效，計(jì)算系列鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和 Et）。 當(dāng) Es在 0.5λ～2.0λ 及 Et在 0.5Es～2.0Es時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗(yàn)。

當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)；當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

4 排除供試液干擾的方法[3]

4.1 樣品稀釋法

選用較高靈敏度的鱟試劑，將供試品進(jìn)一步稀釋（低于最大有效稀釋倍數(shù)）后進(jìn)行干擾試驗(yàn)，一般情況下大部分的干擾作用均能得到有效控制。

4.2 調(diào)節(jié)pH法

測定供試液的pH值，若不在鱟試劑的有效緩沖pH范圍（6.0～8.0），可選用一定濃度的HCl或NaOH將pH值調(diào)節(jié)至6.0～8.0，但要注意應(yīng)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證（干擾試驗(yàn)），確保不干擾鱟試驗(yàn)檢查，且對(duì)內(nèi)毒素檢查結(jié)果無影響。

4.3 超濾法

通過專用超濾系統(tǒng)，將影響內(nèi)毒素檢查的藥物小分子雜質(zhì)濾除，內(nèi)毒素則留存于濾器內(nèi)，濾器內(nèi)加入相應(yīng)的內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行檢查，可在幾乎不影響內(nèi)毒素濃度的前提下盡量避免小分子藥物的干擾作用。

4.4 其他方法

微溫保持加熱法；使用去G因子鱟試劑或廠家提供的專用抗增液對(duì)樣品進(jìn)行稀釋（此時(shí)須進(jìn)行干擾試驗(yàn)）。

5 常規(guī)檢查

使用最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液供試品溶液和供試品陽性對(duì)照溶液，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的常規(guī)檢測。

6 討論

建立新藥品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，首先要結(jié)合臨床最大用量確定其細(xì)菌內(nèi)毒素限值，應(yīng)用兩個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)3批樣品進(jìn)行鱟試驗(yàn)檢查（普通凝膠法或動(dòng)態(tài)濁度法定量試驗(yàn)），如結(jié)果能證實(shí)樣品在不低于最大有效稀釋濃度時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，且樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素常規(guī)檢查結(jié)果為陰性，此時(shí)方可建立該品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[4-7]。

根據(jù)臨床最大用量規(guī)定及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將所研究的新藥細(xì)菌內(nèi)毒素限值定為每毫克主藥（或每毫升）中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于若干EU。經(jīng)干擾實(shí)驗(yàn)確證，該新藥在某個(gè)濃度或低于該濃度時(shí)（但不低于最大有效稀釋濃度MVC）對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。取本品3批，按擬定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，其內(nèi)毒素檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

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