李利義 羅 越 鄭志強 徐 斌 董劍達 韓紹偉

胃癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率居惡性腫瘤第2位，占消化道惡性腫瘤的首位。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移是其最常見的轉(zhuǎn)移方式，是進展期胃癌預后不佳的主要原因。隨著對血管內(nèi)皮生長因子－C(vascular endothelial growth factor C，VEGF－C)研究的深入，VEGF－C誘導胃癌淋巴轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移已成為人們關(guān)注的焦點。趨化因子與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性是近些年國內(nèi)外研究的熱門之一。新近研究表明趨化因子特別是CXCR4(chemokine CXC receptor 4)及其配體所構(gòu)成的信號傳導通路參與調(diào)控細胞內(nèi)肌動蛋白聚合，骨架重排，偽足形成，細胞運動，與腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。我們應(yīng)用免疫組化方法檢測人胃癌中 CXCR4、VEGF－C的表達，探討 CXCR4與VEGF－C表達的相關(guān)性，及其與胃癌臨床病理因素的關(guān)系。

材料與方法

1.材料:收集筆者醫(yī)院外科2008年7月～2010年5月間手術(shù)治療的胃癌患者50例，其中男性28例，女性22例，年齡分布35～80歲，中位年齡61歲，所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學證實，均未接受放療或化療。按照日本胃癌協(xié)會(JGCA)2010年TNM分期標準分期，50例胃癌中Ⅰ期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期22例、Ⅳ期12例。術(shù)后病理:高、中分化癌27例，低分化或未分化癌23例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者12例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)者38例。50例病例中術(shù)后病理學證實有10例發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移。術(shù)后10min內(nèi)每份標本取材于腫瘤組織(T)及遠切端正常胃黏膜組織(N)，全部標本取材后迅速置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.試劑:免疫組織化學SP試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。兔抗人VEGF－C試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。鼠抗人CXCR4為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

3.方法:(1)CXCR4和VEGF－C蛋白表達的檢測:采用鏈霉菌抗生素蛋白－過氧化酶染色法。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替Ⅰ抗，作為陰性對照。(2)結(jié)果判定標準:在組織切片中CXCR4和VEGF－C陽性細胞主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)、細胞膜染為棕黃色。判定標準:采用雙盲法計數(shù)10個高倍視野，陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時忽略較弱或可疑的染色。

4.統(tǒng)計學方法:數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進行分析。根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇χ2檢驗和Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.胃不同組織中CXCR4和VEGF－C的表達情況:在胃正常組織中未見CXCR4蛋白表達。在50例胃癌組織中，有31例CXCR4表達陽性(圖1)，表達率為62%。兩者有顯著性差異(P＜0.01)。在30例胃正常組織中，有2例VEGF－C蛋白表達，表達率為6.67%。在50例胃癌組織中，有36例VEGF－C表達陽性(圖2)，表達率為72%。兩者有顯著性差異(P ＜0.05)。

圖1 胃癌組織CXCR4陽性表達(×400)

圖2 胃癌組織VEGF陽性表達(×400)

2.CXCR4和VEGF－C表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系:胃癌組織中CXCR4和VEGF－C表達水平與腫瘤組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)(P＜0.05)，而與患者性別、年齡及腫瘤大小等無關(guān)(P＞0.05)(表1)。

表1 CXCR4和VEGF－C表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

3.胃癌組織CXCR4表達與VEGF－C表達之間的相關(guān)關(guān)系:50例胃癌組織中，CXCR4和VEGF－C同時陽性表達的有29例，同時陰性表達的有12例，經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示，胃癌組織CXCR4表達與VEGF－C 表達呈顯著正相關(guān)(К =0.597，P ＜0.01)，見表2。提示在胃癌的發(fā)展過程中，CXCR4和VEGF－C的高表達具有協(xié)同促進作用。

表2 胃癌組織CXCR4表達與VEGF－C表達的關(guān)系(n)

討 論

在腫瘤中趨化因子發(fā)揮多種作用，包括控制白細胞浸潤至腫瘤、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的血管生成、激活宿主對腫瘤的特異性免疫應(yīng)答、以自分泌或旁分泌方式刺激腫瘤細胞增殖、控制腫瘤細胞運動等。近年來不少研究指出，趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4所構(gòu)成的CXCL12－CXCR4生物學軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。CXCR4是神經(jīng)纖毛蛋白－1(neuropilin－1，NRP－1)的下游分子，是一個編碼352個氨基酸且高度保守的G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體。CXCR4廣泛表達在于血液、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞中。

Muller等［2］首次報告人乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中高表達趨化因子受體CXCR4，而在乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位如淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨髓則高表達其配體CXCL12。在嚴重聯(lián)合免疫缺陷的小鼠用抗CXCR4的單克隆抗體能有效地抑制人乳腺癌移植瘤的肺轉(zhuǎn)移，其抑制率高達61% ～82%，提示趨化因子及其受體的同步高表達在決定乳腺癌器官特異性轉(zhuǎn)移的過程中起著非常關(guān)鍵的作用。Kazuo Yasumoto等［3］用免疫組化方法檢測胃癌組織中CXCR4的表達，結(jié)果伴有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CXCR4的陽性率為67%，顯著高于無腹膜轉(zhuǎn)移者(25%)。隨后有關(guān)CXCL12－CXCR4生物學軸在其他腫瘤，如非小細胞肺癌、肝癌和結(jié)腸癌等轉(zhuǎn)移發(fā)生過程中的作用的研究也相繼開展，并且在各種體內(nèi)外實驗中也得到了證實［4，5］。

我們應(yīng)用免疫組化的方法，檢測人體胃不同組織中CXCR4的表達情況。結(jié)果表明，正常胃組織不表達CXCR4，而在胃癌組織中，陽性表達率為62%，差異有統(tǒng)計學意義，提示CXCR4可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，CXCR4陽性表達率為25%，而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，CXCR4陽性表達率為73.68%，兩者有顯著差異。伴有腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CXCR4表達率為100%，顯著高于無腹膜轉(zhuǎn)移者52.5%。以上結(jié)果提示趨化因子受體CXCR4的表達可能促進胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移，這與王正林等［6］的研究結(jié)果一致。

血管內(nèi)皮生長因子－C是新生血管形成的重要調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。VEGF－C能特異性作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性，誘導腫瘤血管生成，而新生血管又為腫瘤細胞生長提供營養(yǎng)并間接促進腫瘤細胞增殖［7］。本實驗結(jié)果顯示，正常胃組織中VEGF－C的陽性表達率為6.67%，胃癌組織VEGF－C的陽性表達率顯著升高達72%，差異有統(tǒng)計學意義，提示VEGF－C可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

分析CXCR4和VEGF－C的表達與胃癌臨床病理因素的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，低分化及未分化的胃癌組織的CXCR4和VEGF－C的陽性表達率明顯高于高分化及中分化者，并且隨著腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移、臨床分期的增加，CXCR4和VEGF－C的表達率也明顯增加。以上結(jié)果提示CXCR4和VEGF－C的高表達可能是胃癌預后不良的重要分子標志［8］。CXCR4和VEGF－C的檢測有望成為胃癌分子診斷和病期評估的標志之一。

我們研究了胃癌組織中CXCR4和VEGF－C表達的相關(guān)性，實驗結(jié)果經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析表明兩者表達指數(shù)正相關(guān)(P＜0.01)，說明兩者在胃癌的發(fā)展中存在協(xié)同作用。其可能機制有:①Tao等［9］發(fā)現(xiàn)VEGF－C和NRP－1結(jié)合可以增強腫瘤的存活能力和侵襲活性。所以我們認為，VEGF－C可能通過某種機制調(diào)節(jié)CXCR4的產(chǎn)生或表達，形成VEGF－C－NRP－1－CXCR4信號通路，協(xié)同促進腫瘤細胞向特定器官轉(zhuǎn)移;②抑制腫瘤細胞凋亡:高表達的VEGF可通過誘導趨化因子受體過度表達介導內(nèi)皮細胞移行并抑制凋亡;③促進腫瘤血管形成:Liang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4和 VEGF－C的協(xié)同作用能促進腦腫瘤微血管內(nèi)皮細胞的遷移并抑制其凋亡，而且在體內(nèi)用CXCR4抑制劑可以抑制腫瘤生長和血管形成。下一步本課題組將采用抗CXCR4的單克隆抗體阻斷CXCR4表達以控制胃癌的轉(zhuǎn)移。這對于胃癌的轉(zhuǎn)移，特別是在對腹膜種植轉(zhuǎn)移的防治上，可能提供一個新的分子靶標。

1 Kucia M，Reca R，Miekus K，et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF－1－CXCR4 axis［J］.Stem Cells，2005，23(7):879－894

2 Muller A，Homey B，Soto H，Ge N，Catron D，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis［J］.Nature，2001，410:50－56

3 Kazuo Yasumoto，et al.Role of the CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer［J］.Cancer Res，2006，66(4):2181－2187

4 Xiang Z，Zeng Z，Tang Z，et al.Increased expression of vascular endothelial growth factor－C and nuclear CXCR4 in hepatocellular carcinoma is correlated with lymph node metastasis and poor outcome［J］.Cancer J，2009，15(6):519－25

5 王磊，李健文，馮波，等.趨化因子受體CXCR4在結(jié)腸直腸癌中的表達及意義［J］.外科理論與實踐，2009，14(2):189－192

6 王正林，胡祥，梁品等.趨化因子受體CXCR4在胃癌中的表達及其意義［J］.中華普通外科雜志，2009，18(12):1275 －1279

7 Detoraki A，Staiano RI，Granata F，et al.Vascular endothelial growth factors synthesized by human lung mast cells exert angiogenic effects［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，123(5):1142 －1149

8 Woo IS，Hong SH，Byun JH，et al.Circulating stromal cell derived factor－1 is predictive of distant metastasis in gastric carcinoma［J］.Cancer investigation，2008，26:256 －261

9 Tao J，LI T，Li K，et al.Effect of HIF －1 alpha on VEGF－C induced 1ymphangiogenesis and 1ymph nodes metastases of pancreatic cancer［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26(5):562－564

10 Liang Z，Brooks J，Willard M，et al.CXCR4/CXCL12 axis promotes VEGF－mediated tumor angiogenesis through Akt signaling pathway［J］.Biochemical and Biophysical Res Communications，2007，359(3):716－722