胡潤(rùn)磊 李 滸 柯賢福 王國(guó)卿 魏東山 王 煒

局部熱療是近年來(lái)發(fā)展較快的一種腫瘤治療方法，傳統(tǒng)的熱療方法主要有射頻熱療、微波熱療和超聲熱療等。但是，射頻熱療過(guò)程中由于電場(chǎng)較發(fā)散，不能對(duì)腫瘤準(zhǔn)確的聚焦，從而導(dǎo)致腫瘤周?chē)具^(guò)熱。微波的穿透深度非常有限，常只能作淺表腫瘤的熱療;超聲不能穿透含氣空腔，因此應(yīng)用比較局限。磁流體熱療(magnetic fluid hyperthernia，MFH)是將納米技術(shù)和熱療技術(shù)相結(jié)合的一種新興熱療方法。Jordan首先開(kāi)展了此方面的研究，將磁流體通過(guò)直接注射的方式到達(dá)腫瘤內(nèi)部，磁流體在交變磁場(chǎng)下通過(guò)Neel松弛機(jī)制升溫［1，2］。由于磁性顆粒是通過(guò)直接注射的方式到達(dá)腫瘤內(nèi)部，周?chē)＝M織由于沒(méi)有磁性顆粒的分布，升溫不明顯或不升溫，因此大大提高了熱療的靶向性。本研究將Fe3O4磁流體在交變磁場(chǎng)作用下對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤進(jìn)行了初步研究，研究了其作用機(jī)制，探討了磁流體熱療治療肺癌的可行性。

材料與方法

1.主要材料:(1)試劑:主要試劑:MTT(四唑氮鹽)，DMSO(二甲亞砜)，胰蛋白酶，細(xì)胞培養(yǎng)基粉(RPMI1640)由Sigma公司提供。(2)細(xì)胞株:人肺癌細(xì)胞株A549，由杭州昊天生物有限公司提供。用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。(3)磁流體:納米級(jí)Fe3O4顆粒，采用化學(xué)共沉淀法制成膠體混懸液，呈黑色。樣品粒徑范圍為10～40nm，磁飽和度:磁飽和強(qiáng)度是360GS。樣品使用前均以超聲波處理5min，使Fe3O4顆粒分布更均勻。(4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:4～5周齡BALB/C雌性裸小鼠32只，質(zhì)量20～24g，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2008－0035。飼養(yǎng)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障系統(tǒng)，空氣潔凈度萬(wàn)級(jí)，換氣次數(shù)15次/小時(shí)，溫度21～24℃，濕度75% ～80%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(浙)2008－0113。(5)主要儀器設(shè)備:高頻感應(yīng)加熱機(jī):型號(hào):SP－04AC 4kW，深圳市雙平電源技術(shù)有限公司提供。頻率為率100～250kHz，感應(yīng)線(xiàn)圈由4匝直徑為4mm的銅管平行繞成內(nèi)徑為3cm，長(zhǎng)為4cm的線(xiàn)圈，銅管內(nèi)通循環(huán)水。①流式細(xì)胞儀(FCM):型號(hào)EPICS XL型，美國(guó)Coulter公司;②透射電鏡:JEM－1230型透射電鏡，日本JEOL公司;③測(cè)溫設(shè)備:光纖溫度傳感器，YF－200。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)人肺癌A549裸鼠移植瘤模型的建立:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌 A549細(xì)胞，以0.25%胰酶+0.02%EDTA液進(jìn)行消化，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)后用不含血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml。用1ml注射器分別在裸鼠背部皮下注射上述細(xì)胞懸液0.2ml。觀察小鼠精神、飲食及排便等情況，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，按公式V=ab2/2，估算腫瘤近似體積。(2)磁流體熱療:接種后第21天，各組移植瘤平均直徑約6mm，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將裸鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組、低劑量組，中劑量組、高劑量組，每組8只。2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉。①對(duì)照組:予以1次進(jìn)針、多點(diǎn)注射0.2ml的生理鹽水;②低劑量組:予以1次進(jìn)針、多點(diǎn)注射0.2ml濃度為67.5mg/ml的磁流體，含磁流體約13.5mg;③中劑量組:予以1次進(jìn)針、多點(diǎn)注射0.2ml濃度為90.0mg/ml的磁流體，含磁流體約18mg;④高劑量組:予以1次進(jìn)針、多點(diǎn)注射0.2ml濃度為112.5mg/ml的磁流體，含磁流體約22.5mg。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在注射磁流體后24h，分別在交變磁場(chǎng)作用下作用30min，光纖傳感器測(cè)量腫瘤內(nèi)部和肛門(mén)的溫度。(3)病理學(xué)觀察:加溫后48 h，各組隨機(jī)挑選2只裸鼠，離斷法處死，迅速取出瘤體，剖開(kāi)經(jīng)10%甲醛緩沖液固定，石蠟包埋切片，蘇木素－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織學(xué)變化。另一部分瘤體4%預(yù)冷戊二醛4℃固定過(guò)夜，1%的鋨酸溶液固定樣品1～2h，將經(jīng)過(guò)滲透處理的樣品包埋起來(lái)，70℃加熱過(guò)夜，在Reichert超薄切片機(jī)中切成70～90nm的薄片，用檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，透射電鏡中觀察。(4)熱療對(duì)荷瘤小鼠瘤體的抑制作用:熱療后第21天，離斷法處死所有的荷瘤小鼠，剝?nèi)×鲶w，天平稱(chēng)重。根據(jù)瘤體的體積計(jì)算各組的腫瘤體積抑制率，腫瘤體積抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組瘤體體積/對(duì)照組瘤體體積)×100%。根據(jù)各組荷瘤小鼠瘤重計(jì)算腫瘤的質(zhì)量抑制率，腫瘤質(zhì)量抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量/對(duì)照組瘤體質(zhì)量)×100%。

結(jié) 果

1.移植瘤生長(zhǎng)情況:裸鼠一般情況及皮下成瘤:32只裸鼠成瘤，成瘤率100% ，瘤結(jié)節(jié)形成時(shí)間為細(xì)胞種植后第4～13天，集中在第8～10天。腫瘤細(xì)胞種植后第21天，腫瘤直徑平均達(dá)6mm。成瘤后早期裸鼠的體質(zhì)量和活動(dòng)情況沒(méi)有明顯改變，隨著腫瘤形成并逐漸增大，裸鼠逐漸出現(xiàn)消瘦，活動(dòng)減少。

2.磁流體熱療對(duì)移植瘤的抑制作用:磁流體在低劑量組、中劑量組、高劑量組瘤體的平均溫度分別為41.3℃、44.5℃、46.8℃，小鼠肛門(mén)溫度在 30 ～ 34℃之間。熱療后第21天，4組的體積分別為:對(duì)照組831.0 ±126.2mm3、低劑量組 713.2 ±157.1mm3、中劑量組399.2 ±199.2mm3、高劑量組 247.3 ±102.0mm3。低、中、高劑量組體積抑制率分別為14.1%、51.9%、70.2%。方差分析組間差異顯示，與對(duì)照組比較，中劑量組、高劑量組腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。低劑量組的腫瘤體積與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)，各組腫瘤體積增長(zhǎng)趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 各組A549肺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

4組的瘤體重量分別為:對(duì)照組1.71±1.11g，低劑量組1.51 ±0.25g，中劑量組 0.93 ±0.40g，高劑量組0.65 ±0.21g，低、中、高劑量組質(zhì)量抑瘤率分別為11.7%、45.6%、62.0%，方差分析組間差異顯示，與對(duì)照組比較，中劑量組、高劑量組腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組的腫瘤重量與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)(表1)。

表1 不同劑量的磁流體熱療后對(duì)小鼠瘤體體積和質(zhì)量抑制作用

3.熱療后移植瘤的病理學(xué)觀察:(1)大體觀察:磁流體熱療后，對(duì)照組的移植瘤體積進(jìn)行性增長(zhǎng)，瘤體表面光整。實(shí)驗(yàn)組瘤體表面顏色出現(xiàn)暗淡(磁流體的顏色為褐色)，出現(xiàn)表面結(jié)痂，進(jìn)而出現(xiàn)局部壞死，壞死脫落后表面凹凸不平，腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，以高劑量組瘤體最明顯。(2)光鏡觀察:低劑量組肺癌細(xì)胞在熱療后正常形態(tài)無(wú)明顯改變，細(xì)胞區(qū)域看到磁流體的分布，中劑量組的肺癌細(xì)胞在熱療后出現(xiàn)局部凝固樣壞死改變，表現(xiàn)為嗜酸性增強(qiáng)，在壞死區(qū)域有磁流體的分布。高劑量組肺癌細(xì)胞同樣出現(xiàn)凝固樣壞死改變，但壞死區(qū)域較中劑量組明顯增加，在壞死區(qū)域有磁流體的分布(圖2)。

圖2 各組腫瘤在磁流體熱療后的光鏡下表現(xiàn)(HE×400)

4.電鏡觀察:低劑量組肺癌細(xì)胞在熱療后與對(duì)照組肺癌細(xì)胞比較無(wú)明顯變化;中劑量組肺癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡樣改變，表現(xiàn)為染色體邊聚、胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核裂解;高劑量組肺癌細(xì)胞核呈現(xiàn)溶解，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，呈壞死表現(xiàn)(圖3)。

圖3 各組肺癌細(xì)胞磁流體熱療后的透射電鏡觀察

討 論

肺癌是嚴(yán)重危害人民生命健康的常見(jiàn)疾病。其發(fā)病率和病死率已居所有癌癥之首［1］。但由于大部分患者發(fā)現(xiàn)已屬晚期，手術(shù)效果差，傳統(tǒng)的放化療由于不良反應(yīng)大且價(jià)格昂貴，多數(shù)患者不能耐受。因此，探索一種新的有效的治療肺癌的方法成為我們工作首要任務(wù)。近年來(lái)，以射頻為主的傳統(tǒng)的熱療方法對(duì)肺癌的局部控制起到了良好的作用，但是射頻加溫由于電場(chǎng)較發(fā)散，不能對(duì)腫瘤準(zhǔn)確定位，導(dǎo)致脂肪過(guò)熱，因此靶向性差，應(yīng)用比較局限［2］。

磁流體熱療的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是高度靶向性和特異性，我們將磁流體熱療對(duì)裸鼠肺癌移植瘤進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)磁流體在腫瘤內(nèi)部可以升溫至有效的治療溫度，而小鼠肛門(mén)溫度卻穩(wěn)定在30～34℃之間，說(shuō)明周?chē)＝M織沒(méi)有明顯的升溫，初步實(shí)現(xiàn)了磁流體熱療的靶向性。

研究證實(shí)，熱療的有效溫度是 ＞42.0℃［3］。Ivkov等［4］報(bào)道當(dāng)磁流體的溫度升高至有效溫度以后，磁流體熱療對(duì)腫瘤的抑制效果與溫度呈劑量－效果依賴(lài)關(guān)系。我們將不同劑量的磁流體注射到瘤體內(nèi)部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量組的腫瘤內(nèi)部溫度升溫至41.3℃左右，沒(méi)有明顯的抑瘤效果，而中、高劑量組的溫度均升高至42.0℃以上，抑瘤效果明顯，高劑量組的抑瘤效果較中劑量組明顯(P＜0.05)。與上述報(bào)道基本一致，證實(shí)了磁流體熱療的可操作性。

研究表明，熱療可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致壞死，在42.0～46.0℃條件下，腫瘤細(xì)胞已凋亡為主，在46.0℃以上的條件下，高溫可以直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死［5］。我們通過(guò)光鏡觀察，中、高劑量組腫瘤細(xì)胞加熱后大量出現(xiàn)凝固性壞死的征象，表現(xiàn)為嗜酸性增強(qiáng)，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，核碎裂、溶解;在壞死的一些區(qū)域偶可見(jiàn)出血灶，表現(xiàn)為壞死腫瘤細(xì)胞周?chē)罅康募t細(xì)胞分布，血管破裂;磁流體分布于凋亡和壞死的區(qū)域中。電鏡觀察中劑量組腫瘤細(xì)胞呈典型的凋亡樣改變，表現(xiàn)為染色質(zhì)邊集、胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核裂解，在高劑量組，細(xì)胞核呈現(xiàn)溶解，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，呈壞死表現(xiàn)。證實(shí)磁流體熱療可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，在高溫時(shí)直接導(dǎo)致肺癌細(xì)胞壞死。

但磁流體熱療對(duì)腫瘤的具體作用機(jī)制目前還有爭(zhēng)議，翟羽等［6］研究發(fā)現(xiàn)，磁流體熱療后實(shí)驗(yàn)組腫瘤的細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯增加，誘導(dǎo)凋亡不是抑制移植瘤生長(zhǎng)的主要原因，可能與研究的條件、腫瘤的屬性等因素有關(guān)。

總之，我們的結(jié)果證實(shí)磁流體熱療對(duì)肺癌裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，熱療后肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡和壞死樣改變，在有效溫度范圍的抑瘤效果與溫度呈劑量－效果依賴(lài)關(guān)系。將為磁流體熱療在肺癌領(lǐng)域的進(jìn)一步深入研究打下良好的基礎(chǔ)。

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3 Tseng HY，Lee GB，Lee CY，et al.Localised heating of tumours utilising injectable magnetic nanoparticles for hyperthermia cancer therapy［J］.IET Nanobiotechnol，2009，3(2):46－54

4 Ivkov R，DeNardo SJ，Daum W，et al.Application of high amplitude alternating magnetic fields for heat induction of nanoparticles localized in cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11(19 Pt 2):7093－7103

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