陳苗苗，林良才，馬昱澍，王風(fēng)清，魏東芝

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

甾體激素在臨床上應(yīng)用廣泛，是僅次于抗生素的第二大類藥物。目前甾體藥物的合成主要依賴于半合成，常用方法是利用微生物轉(zhuǎn)化和化學(xué)修飾相結(jié)合的方式對(duì)天然甾體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造[1]。其中，C1，2位脫氫反應(yīng)是甾體微生物轉(zhuǎn)化中最重要的反應(yīng)類型[2]。許多具有抗炎活性的甾體藥物在C1，2位導(dǎo)入雙鍵后，能成倍地增加抗炎活性[3]。3-酮基-4-烯-甾體的C1，2位脫氫反應(yīng)一般由3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstD)負(fù)責(zé)[4]。目前，放線菌屬的多種細(xì)菌被證實(shí)存在KstD活性，如簡(jiǎn)單節(jié)桿菌[5]、紅球菌[6]、分枝桿菌[7]、諾卡氏菌[8]等。為了提高野生菌活性，研究者嘗試對(duì)KstD進(jìn)行異源表達(dá)。大腸桿菌是最成功和最有效的異源表達(dá)宿主之一[9，10]，該系統(tǒng)具有成本低廉、生產(chǎn)效率高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)KstD在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，活性卻幾乎為零[11]；同時(shí)，將紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)KstD在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，所得KstD蛋白中40%～50%為包涵體，且重組菌不具有C1，2位脫氫活性[12]。此外，由于大腸桿菌沒(méi)有甾體泵入泵出機(jī)制，只能靠發(fā)酵液中分子的自然擴(kuò)散，而甾體是幾乎不溶于水的，因此，雖然對(duì)于各種KstD在大腸桿菌系統(tǒng)中異源表達(dá)的研究較多，但其甾體轉(zhuǎn)化效果并不十分理想。

煙曲霉酸是煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的次生代謝產(chǎn)物，其C1，2位有雙鍵結(jié)構(gòu)[13]，據(jù)推測(cè)煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇中含有負(fù)責(zé)3-甾酮-Δ1-脫氫反應(yīng)[13，14]的基因。煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇已經(jīng)被全基因測(cè)序(Genbank )，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的kstD序列與基因簇序列同源比對(duì)分析，得到唯一一個(gè)具有同源性的編碼基因，命名為kstDF。推測(cè)煙曲霉素1，2位的雙鍵就是此基因脫氫形成的。煙曲霉能高效產(chǎn)生煙曲霉酸，預(yù)示著KstDF應(yīng)該有較強(qiáng)的C1，2位脫氫能力，如果在異源表達(dá)過(guò)程中能表現(xiàn)出良好的活性，該酶就很適合用來(lái)開發(fā)高活性的甾體C1，2位脫氫反應(yīng)的基因工程菌。加之kstDF來(lái)源新穎，從序列上分析，該基因與細(xì)菌源kstD核苷酸相似性較低，也具有很高的研究?jī)r(jià)值。

作者首次克隆了煙曲霉煙曲霉酸合成基因簇中的kstDF，并驗(yàn)證了該真菌基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達(dá)效果，研究了不同誘導(dǎo)條件下KstDF的蛋白表達(dá)和活性，進(jìn)而確定KstDF表達(dá)最有利的實(shí)驗(yàn)條件，最后考察了該重組菌轉(zhuǎn)化甾體藥物的最大能力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

煙曲霉(A.fumigatus) 菌株CICC 40167，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。大腸桿菌DH5α、BL21(λDE3)及質(zhì)粒pET28a(+)，Novagen公司。

大腸桿菌LB培養(yǎng)基：Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，加水至1000 mL；若配制固體培養(yǎng)基，再加入15 g瓊脂。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、LATaq酶、T4 DNA連接酶、pMD19-T Simple Vector，TaKaRa公司。Plasmid Miniprep Kit、DNA Gel Extraction Kit、Cycle pure Kit，美科美(北京)生物醫(yī)學(xué)科技有限公司。引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 煙曲霉基因組的提取[15]

將從培養(yǎng)皿上刮取的菌體或抽濾收獲的菌體放入研缽中，加液氮后研磨成粉末。向該粉末中以一定比例(2 mL/0.1 g粉末)加入一定量的DNA抽提液[0.2 mol·L-1Tris-HCl(pH值7.5)，NaCl 0.5 mol·L-1，EDTA 0.01 mol·L-1，SDS 1%]和與抽提液等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液(體積比為25∶24∶1)，于渦旋器上劇烈渦旋3～6 min，然后8000 r·min-1、4 ℃離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到一新離心管，向該離心管中加入2.5 BV的無(wú)水乙醇，-20 ℃放置30 min。取出離心管，10 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄上清液，在空氣中放置10 min使乙醇揮發(fā)完全。加入適量的TE溶液[10 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.4)，1 mmol·L-1EDTA(pH值8.0)]溶解沉淀即得到基因組DNA。

1.4 煙曲霉kstDF基因的克隆

運(yùn)用同源序列比對(duì)從煙曲霉酸基因簇中釣取出kstDF序列全長(zhǎng)，根據(jù)kstDF基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物kstDF-U：5′-CCGAGAATTCATGGCCGCAAGACAGCTC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))和kstDF-D：5′-ATGCAAGCTTCTATACATGCTCAGAAGCAATAT-3′(下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn))。

以煙曲霉基因組DNA為模板，用上述引物擴(kuò)增kstDF基因。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 25.0 μL，5′-端引物1.0 μL，3′-端引物1.0 μL，模板DNA 0.2 μL，ddH2O 23.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，29個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min，4 ℃保溫。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒pET28a(+)分別用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過(guò)夜連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別用PCR和雙酶切法進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序。再將驗(yàn)證完全正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌 BL21(λDE3)中，獲得產(chǎn)KstDF的基因工程菌。

1.6 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)在大腸桿菌中的表達(dá)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

按1%接種量，將上述基因工程菌接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1卡那霉素)中，于37 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)，同時(shí)以空宿主BL21(λDE3)作對(duì)照。待OD600至0.4～0.6，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，分別于20 ℃、30 ℃、37 ℃的誘導(dǎo)溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，150 r·min-1培養(yǎng)6 h，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。檢測(cè)菌液的OD600，7000 r·min-1、4 ℃離心5 min，收集菌體，用0.05 mol·L-1pH值7.5 Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1Tris，0.04 mol·L-1HCl)重懸，將OD600濃縮至4.0。取100 μL濃縮后的菌液，加入一定量的蛋白上樣緩沖溶液，煮沸5 min，取10 μL進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。

1.7 3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KstDF)的活性檢測(cè)

向10 mL不同誘導(dǎo)溫度下的重組大腸桿菌濃縮液和BL21(λDE3)濃縮液中分別加入終濃度為13.3 mg·L-1的底物雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD，用乙醇溶解)，在30 ℃、200 r·min-1條件下進(jìn)行反應(yīng)，12 h后取樣1 mL，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，然后12 000 r·min-1離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈離心管進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)。同時(shí)，將20 ℃誘導(dǎo)6 h的菌株加入AD反應(yīng)2 h后，用乙酸乙酯萃取3次，進(jìn)行HPLC分析。

1.8 TLC和HPLC分析方法

TLC分析方法：采用硅膠G板薄層層析技術(shù)分離底物AD和目標(biāo)產(chǎn)物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，展層劑中石油醚和乙酸乙酯的體積比為3∶2，點(diǎn)樣量為30 μL。點(diǎn)樣結(jié)束后，將薄板置于層析缸中，待層析液的前沿遷移至距離硅膠板前沿1 cm時(shí)，取出硅膠板。向硅膠板上噴淋15%(體積分?jǐn)?shù))硫酸，100 ℃烘烤10 min，待板上物質(zhì)顯色完全后進(jìn)行分析鑒定。

HPLC分析方法：將用于TLC的樣品置于通風(fēng)櫥中，待乙酸乙酯揮發(fā)干，向離心管中加入等體積色譜級(jí)甲醇，振蕩使沉淀溶解，12 000 r·min-1離心10 min，取出上清進(jìn)行HPLC實(shí)驗(yàn)。色譜條件：Agilent1100型高效液相色譜儀，Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm)色譜柱，柱溫40 ℃；采用DAD紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相為甲醇∶水=7∶3，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

1.9 大腸桿菌表達(dá)KstDF酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以HPLC法檢測(cè)大腸桿菌以AD為底物表達(dá)KstDF的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定過(guò)程中，酶的濃度恒定，改變底物的濃度(不存在底物過(guò)量的情況)，測(cè)得一組反應(yīng)初速度。檢測(cè)菌液OD600，7000 r·min-1、4 ℃離心5 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖溶液(pH值7.5)重懸，將OD600濃縮至4.0。超聲處理破碎細(xì)胞(功率200 W，每超聲5 s間隔20 s，共超聲10次，全程在冰上操作)，得到細(xì)胞破碎液。1 mL反應(yīng)混合物(5 mL管盛裝)由800 μL大腸桿菌破碎液、150 μmol·L-1吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)以及一定濃度的底物AD組成[每個(gè)反應(yīng)體系對(duì)應(yīng)的AD濃度(μmol·L-1)分別為8、16、32、64、100、128]，在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)15 min。向每管各加乙酸乙酯萃取3次，12 000 r·min-1離心10 min，取上層溶液，待有機(jī)相揮發(fā)后，加1 mL甲醇復(fù)溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上層溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)的克隆

根據(jù)煙曲霉的kstDF(Genbank accession number XM_746255)全長(zhǎng)基因序列，擴(kuò)增目的基因kstDF。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1.kstDF

由圖1可知，kstDF基因大小約1791 bp，不包含任何內(nèi)含子，編碼596個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為64.53 kDa，等電點(diǎn)為7.81(http：//www.expasy.org/cgi-bin/protparam)。與已報(bào)道的玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159 3-甾酮-Δ1-脫氫酶的kstD的氨基酸序列一致性為51%。在KstDF氨基酸序列的N端含有保守的FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即GSG(A/G)(A/G)(A/G)X17E(圖2)。推測(cè)煙曲霉KstDF的活性中心是位于296～323位的27個(gè)氨基酸：GERSIRARCGVLLCAGGFAHNQGLRER。

M.tubertulosis:結(jié)核分枝桿菌KstD R.erythropolis：紅平紅球菌KstD A.simplex：簡(jiǎn)單節(jié)桿菌KstD A.fumigatus：煙曲霉KstD；實(shí)線方框和虛線方框分別指示FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶活性中心

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將來(lái)源于煙曲霉的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因(kstDF)克隆到質(zhì)粒pET28a(+)中，所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(λDE3)，隨機(jī)選擇可能的陽(yáng)性重組子進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳分析如圖3所示。

A：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 1.煙曲霉kstDF B：M′.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 1′.Hind Ⅲ和Eco RⅠ酶切pET28a(+)-kstDF 2′.pET28a(+)-kstDF

由圖3可知，PCR擴(kuò)增出的條帶大小約為1800 bp，與實(shí)際kstDF大小(1791 bp)相符，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切獲得大小分別為5400 bp[pET28a(+)]和1800 bp(kstDF)的兩條DNA片段，說(shuō)明重組菌株構(gòu)建成功，命名為BL21(DE3)-pET28a-kstDF。

2.3 KstDF的表達(dá)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

重組菌在三個(gè)不同的溫度下(20 ℃、30 ℃、37 ℃)分別進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，150 r·min-1誘導(dǎo)6 h后，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖4所示。

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 1.E.coli BL21(λDE3) 2，3.20 ℃誘導(dǎo) 4，5.30 ℃誘導(dǎo) 6，7.37 ℃誘導(dǎo)

由圖4可知，目的蛋白大小約為66 kDa(箭頭指示位置)，與對(duì)照相比，BL21-pET28a-kstDF目的蛋白的表達(dá)量較高，且不同誘導(dǎo)溫度的蛋白表達(dá)差異明顯。20 ℃表達(dá)量最低，37 ℃表達(dá)量最高，蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)溫度的升高而增加。

2.4 KstDF重組大腸桿菌對(duì)底物AD的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化

向不同誘導(dǎo)條件下的大腸桿菌中分別加入終濃度為13.3 mg·L-1的底物AD，30 ℃、200 r·min-1條件下反應(yīng)12 h，萃取3次，TLC分析C1，2位脫氫產(chǎn)物ADD的生成量，結(jié)果如圖5所示。

1.E.coli BL21(λDE3) 2.20 ℃誘導(dǎo) 3.30 ℃誘導(dǎo) 4.37 ℃誘導(dǎo)

由圖5可知，37 ℃誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量最高，但是酶活最低，底物AD有很多剩余；而20 ℃誘導(dǎo)的菌體，雖然蛋白表達(dá)量較低但酶活最高，將AD全部轉(zhuǎn)化為ADD。由此推測(cè)低溫誘導(dǎo)有利于KstDF的酶活表達(dá)；高溫誘導(dǎo)時(shí)，在相同時(shí)間內(nèi)KstDF表達(dá)量比低溫誘導(dǎo)的表達(dá)量高很多，可能因?yàn)楸磉_(dá)速度過(guò)快導(dǎo)致大量KstDF非正確折疊，失去生物學(xué)活性。

2.5 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化AD的HPLC分析

將20 ℃誘導(dǎo)6 h的菌株加入AD反應(yīng)2 h，萃取3次，揮發(fā)干燥，再用甲醇溶解固形物，用C18色譜柱分析，結(jié)果如圖6所示。

1.ADD 2.AD

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)品ADD摩爾濃度與254 nm下光吸收值之間的關(guān)系曲線)，積分計(jì)算峰面積，比上各自的消光系數(shù)，就可以推算出轉(zhuǎn)化率。經(jīng)計(jì)算，反應(yīng)2 h，約17%的AD轉(zhuǎn)化為ADD。張藝[16]報(bào)道簡(jiǎn)單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化AD的水平為：投入5 mg·L-1底物AD反應(yīng) 48 h后，轉(zhuǎn)化率為45%。與之相比，本研究重組菌的活性表現(xiàn)良好。但是，Li等[11]報(bào)道，轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單節(jié)桿菌kstD的重組枯草桿菌48 h轉(zhuǎn)化1 g·L-1AD的轉(zhuǎn)化率為45.3%。因此，重組大腸桿菌離生產(chǎn)應(yīng)用仍存在一定差距，這可能是因?yàn)榇竽c桿菌沒(méi)有甾體物質(zhì)主動(dòng)運(yùn)輸機(jī)制，且甾體物質(zhì)的水溶性很差，因此其傳質(zhì)和反應(yīng)效率無(wú)法與那些可以主動(dòng)攝取甾體的生產(chǎn)菌株(如分支桿菌、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌等)相比較。

2.6 大腸桿菌表達(dá)KstDF的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以HPLC法檢測(cè)大腸桿菌以AD為底物表達(dá)KstDF的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。取一定量粗酶液加入不同濃度的底物AD，將反應(yīng)液在30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)15 min。加乙酸乙酯終止反應(yīng)，萃取代謝產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析?；贚ineweaver and Burk方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，x軸為1/[AD]、y軸為1/v。根據(jù)雙倒數(shù)法公式，Km等于x軸截距的倒數(shù)的負(fù)數(shù)，計(jì)算得Km值為0.2 mmol·L-1。Mycobacteriumsp.VKM Ac-1817D以9-OH-AD為底物表達(dá)KstD時(shí)Km值為(0.81±0.20)mmol·L-1，由于AD的水溶性更低，Km值必然更高[17]。相比之下，本實(shí)驗(yàn)KstDF與底物AD顯示出較好的親和力。

圖7 BL21-pET28a-kstDF表達(dá)KstD反應(yīng)動(dòng)力學(xué)雙倒數(shù)圖

2.7 討論

從A.fumigatus克隆出一個(gè)真菌來(lái)源的kstDF基因，首次鑒定了該基因的3-甾酮-Δ1-脫氫酶功能。該基因編碼596個(gè)氨基酸，與該基因同源性最高的是來(lái)源于玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159的kstD，兩者氨基酸序列一致性為51%。與細(xì)菌來(lái)源的KstD比對(duì)后發(fā)現(xiàn)kstDF的氨基酸序列包含相似FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和活性中心。

關(guān)于3-甾酮-Δ1-脫氫酶的研究報(bào)道很多，其中功能基因得到鑒定的3-甾酮-Δ1-脫氫酶包括簡(jiǎn)單節(jié)桿菌[5]、珊瑚諾卡氏菌[18]、灰暗諾卡氏菌[19]、偶發(fā)分枝桿菌[7]和紅串紅球菌[6]等。但是以上KstD的研究都是局限在細(xì)菌范圍內(nèi)，沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)關(guān)于真菌KstD的報(bào)道。基于Lodeiro等[14]報(bào)道的煙曲霉產(chǎn)煙曲霉酸基因簇序列，以及對(duì)煙曲霉酸結(jié)構(gòu)的分析，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)KstDF負(fù)責(zé)煙曲霉酸C1，2位脫氫反應(yīng)。通過(guò)克隆和大腸桿菌異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，KstDF顯示不同于細(xì)菌來(lái)源KstD的特點(diǎn)，在大腸桿菌中表現(xiàn)良好的活性。分析原因可能是與細(xì)菌來(lái)源的膜蛋白相比[5，7，20，21]，真菌來(lái)源KstDF溶解性較好，結(jié)合并催化等量甾體物質(zhì)的相對(duì)酶濃度更高，從而表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性。本研究首次鑒定了一個(gè)真菌來(lái)源KstD，該酶具有將AD脫氫轉(zhuǎn)化為ADD的活力。通常真菌中具有龐大的甾體轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，但很少被了解和研究。本研究為開發(fā)真菌資源在科研和應(yīng)用方面的價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以煙曲霉(A.fumigatus)為出發(fā)菌株，運(yùn)用同源序列比對(duì)從煙曲霉酸基因簇中釣取出kstDF序列。該基因與玫瑰色熱微菌(Thermomicrobiumroseum) DSM 5159的kstD一致性為51%。構(gòu)建pET28a(+)-kstDF表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(λDE3)，獲得高表達(dá)重組子菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)高溫(37 ℃)有利于KstDF蛋白表達(dá)，低溫(20 ℃)有利于酶活的保持。實(shí)驗(yàn)中該重組菌顯示出良好的甾體轉(zhuǎn)化能力，在12 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化13.3 mg·L-1雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)，為構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化3-酮基-4-烯類固醇的基因工程菌奠定了基礎(chǔ)。

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