范鑫歆， 畢開(kāi)順， 馬 超， 魯雪峰， 陳曉輝

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110016)

牽牛子為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitis nil(L.)Choisy或圓葉牽牛 P.purpurea(L.)Voigt的干燥成熟種子，收載于2010版《中國(guó)藥典》。具有瀉水通便，消痰滌飲，殺蟲(chóng)攻積等作用。用于水腫漲滿(mǎn)、二便不通、痰飲積聚、氣逆喘咳和蟲(chóng)積腹痛等［1］。牽牛子脂肪油為淡黃色或黃色的澄明油狀液體，味淡，無(wú)臭，為牽牛子中有效成分，含有量較大。近年來(lái)，僅有氣-質(zhì)聯(lián)用法對(duì)牽牛子脂肪油中成分進(jìn)行鑒定的報(bào)道［2］，但未見(jiàn)對(duì)其成分進(jìn)行定量測(cè)定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牽牛子脂肪油中5種脂肪酸測(cè)定方法進(jìn)行了研究［3-10］，以期為控制牽牛子脂肪油的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 6890A毛細(xì)管氣相色譜儀，Agilent 2000色譜工作站，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，AGBP210S電子分析天平(Sartorius公司)。棕櫚酸甲酯(批號(hào):18824)、硬脂酸甲酯(批號(hào):13450)、油酸甲酯(批號(hào):18834)、亞油酸甲酯(批號(hào):20040)、亞麻酸甲酯(批號(hào):20196)、豆蔻酸甲酯(批號(hào):14337)均由北京百靈威化學(xué)試劑有限公司提供，純度均大于99%。石油醚、正己烷和無(wú)水硫酸鈉等均為分析純，購(gòu)自天津大茂化學(xué)試劑廠。牽牛子藥材共10批，產(chǎn)地分別為浙江，江蘇，上海，黑龍江，河北，遼寧，四川，吉林，天津，山東等，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitis nil(L.)Choisy的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂肪油的提取 將不同產(chǎn)地的樣品粉碎，過(guò)40目篩，取約10 g，精密稱(chēng)定，置500 mL圓底燒瓶中，加入石油醚70 mL，回流提取10 h，濾過(guò)，減壓回收石油醚得總脂肪油。計(jì)算得油率，結(jié)果浙江，江蘇，上海，黑龍江，河北，遼寧，四川，吉林，天津，山東分別為 6.7%，20%，16.7%，17.0%，15.6%，9.5%，10.5%，13.3%，15.6%，12.9%。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取對(duì)照品棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯適量，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為 5.95、5.52、5.48、6.44、4.52 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯對(duì)照品溶液 3、1、2、4、0.4 mL 置同一 25 mL量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，得到混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取豆蔻酸甲酯適量，置25 mL量瓶中，用正己烷溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.52 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 供試品溶液 取脂肪油約100 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL圓底燒瓶中，加入0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液5 mL，置60℃水浴回流皂化30 min，至油珠全部消失，放冷，加15%三氟化硼乙醚的甲醇溶液2 mL，置60℃水浴酯化5 min，放冷，精密加入正己烷5 mL，超聲2 min，取出，置于分液漏斗中，加飽和氯化鈉溶液10 mL，振搖，靜置，取上層溶液，加無(wú)水硫酸鈉干燥，再精密量取干燥后的溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);氫火焰離子化檢測(cè)器(FID);進(jìn)樣口溫度230℃;檢測(cè)器溫度250℃;柱溫以170℃為起始溫度，以10℃/min升至230 ℃，保持5 min;載氣N2，體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比15∶1;進(jìn)樣量1 μL。在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按亞油酸計(jì)算大于1.0×105，各峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，各峰拖尾因子均在0.95～1.05之間。對(duì)照品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance(A)and sample(B)

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6、8 mL 置10 mL 量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下測(cè)定。以各對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。棕櫚酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯回歸曲線方程分別為:Y=26.87X+1.830 ×10－2，r=0.9996;Y=21.98X+8.60 × 10－3，r=0.9996;Y=24.64X+2.030 × 10－2，r=0.9998;Y=22.86X+3.260 × 10－2，r=0.9997;Y=23.54X+5.200 ×10－3，r=0.9994。棕櫚酸甲酯，硬脂酸甲酯，油酸甲酯，亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯分別在0.04～0.57 mg/mL，0.01 ～ 0.18 mg/mL，0.02 ～ 0.35 mg/mL，0.05 ～0.82 mg/mL，0.004 ～ 0.06 mg/mL 范圍內(nèi)，與內(nèi)標(biāo)峰面積比值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比值計(jì)算 RSD，結(jié)果分別為 0.9%，1.1%，1.4%，1.0%，1.5%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)藥材(江蘇)6份，按2.1項(xiàng)及2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸含量的 RSD 分別為 1.3%，1.6%，1.5%，1.6%，2.0%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫放置，于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 分別進(jìn)樣分析，計(jì)算棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯各時(shí)間點(diǎn)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為 1.0%，1.4%，1.5%，1.2%，1.9%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知量的同一批號(hào)牽牛子脂肪油(江蘇)約50 mg，共9份，按低、中、高濃度分別加入各對(duì)照品貯備液，每一濃度3份。按照2.2.3項(xiàng)下方法操作制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定 取不同產(chǎn)地牽牛子脂肪油約100 mg，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在上述色譜條件下測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 本研究考察了 DB-17，DBWax 3種不同型號(hào)的石英毛細(xì)管柱，結(jié)果表明DBWax石英毛細(xì)管柱能夠使待測(cè)脂肪酸組分具有良好的分離和合適的保留時(shí)間。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery tests(n=9)

表2 牽牛子油測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination results of fatty acid in seed of Pharbitis nil(L.)Choisy

3.2 柱溫的考察 曾嘗試200℃恒溫測(cè)定，結(jié)果分析時(shí)間較長(zhǎng)，且拖尾嚴(yán)重。嘗試170～230℃程序升溫的方式，色譜峰分離度好，且峰型良好，因此確定程序升溫條件為初始溫度170℃，以10℃/min升溫，升至230℃。

3.3 提取方法的考察 研究中以石油醚(60～90℃)為提取溶劑，對(duì)索氏提取8 h和回流提取8 h，分別進(jìn)行了考察，結(jié)果證明兩種方法的提取率差別不大，因此選用較為方便的回流提取法。在此基礎(chǔ)上對(duì)不同的提取時(shí)間(6，8，10，12 h)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明提取10 h與提取12 h牽牛子脂肪油的提取率基本一致，故確定提取時(shí)間為10 h。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批樣品測(cè)定的結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的牽牛子脂肪油中棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低和最高相差5倍左右，這可能與生長(zhǎng)環(huán)境、干燥方法和貯存時(shí)間不同有關(guān)。測(cè)定結(jié)果表明牽牛子脂肪油中亞油酸量最高，占總油的34.6%，亞油酸具有降低血液中膽固醇的濃度，減少膽固醇在血管壁沉積的生理活性［11-13］。因此，牽牛子脂肪油的藥用資源有待于進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與利用，本研究為牽牛子脂肪油的進(jìn)一步臨床應(yīng)用價(jià)值和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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