任李玥，劉小莉

(1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明 650500;2.云南省食品藥品檢驗(yàn)所，云南昆明 650011)

胡黃連Neopicrorhiza scrophulariiflora(Pennell)Hong為玄參科Scrophulariaceae胡黃連屬Neopicrorhiza的多年生草本植物，分布區(qū)狹窄，特產(chǎn)東喜馬拉雅和橫斷山區(qū)［1］。根狀莖為重要的中、藏藥材，具有清濕熱，除骨蒸、消疳熱的功效［2］。由于過度采挖，資源瀕臨枯竭，作為國家二級(jí)保護(hù)植物，列入《中國珍稀瀕危保護(hù)植物名錄》中［3］。對(duì)其繼續(xù)科學(xué)保護(hù)和合理利用已刻不容緩。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性 (SRAP，Sequence—related Amplified Polymorphism) 是由 Li 和 Quiros［4］于2001年發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記。其原理是針對(duì)基因外顯子中GC含量豐富，而啟動(dòng)子、內(nèi)含子中AT含量豐富的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)兩組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與外顯子間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性。該標(biāo)記具有簡便、高效、產(chǎn)率高、高共顯性、重復(fù)性好、易測序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)，已成功地應(yīng)用于多個(gè)物種遺傳多樣性分析［5－6］、遺傳圖譜的構(gòu)建［7］等方面。對(duì)不同植物類群而言，SRAP的最佳反應(yīng)條件會(huì)有所差別，本實(shí)驗(yàn)擬摸索適合胡黃連SRAP擴(kuò)增反應(yīng)的條件，為后續(xù)基于SRAP探討胡黃連的遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用樣品采自西藏定日縣 (N86°26'，E28°08'，4248m)胡黃連幼嫩葉片，硅膠干燥后保存于－20℃。

1.2 試劑

瓊脂糖購自GENE TECH(SHANGHAI)COMPANY LIMITED;Tris－HCl、EDTA購自美國 AMResco公司;二甲基亞砜購自云科生物工程公司;SRAP引物由上海生物工程有限公司合成;dNTPs、RNA酶、Taq酶購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器

Eppendorf AG離心機(jī)，Biometra PCR儀，BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)，BIO－RAD電泳儀，Bio-Photometer plus核酸蛋白測定儀，XW－80A型漩渦混合器等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA提取與檢測

采用改良的CTAB法提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，根據(jù)樣品OD260/OD280計(jì)算DNA純度;根據(jù)OD260值計(jì)算樣品DNA濃度，稀釋至10 ng·μL－1，保存于－20℃冰箱中。

1.4.2 正交反應(yīng)體系建立

由于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，模板DNA在很大的一個(gè)濃度范圍內(nèi)對(duì)PCR反應(yīng)體系均無影響，因此本文未對(duì)DNA模板濃度進(jìn)行優(yōu)化，而是在20μL反應(yīng)體系中直接選用20ngDNA作為模板。參考狗牙根［5］、丹參［8］的 SRAP 反應(yīng)條件，初設(shè)dNTP、Taq酶、Mg2+、引物濃度、模板濃度各4個(gè)水平，dNTP分別為150，200，250，300μmol·L－1;Taq酶分別為 0.5，1.0，1.5，2.0U;Mg2+分別為1.5，2.0，2.5，3.0mmol·L－1;引物濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5μmol·L－1;模板濃度5，10，15，20ng形成5因素4水平的試驗(yàn)方案。反應(yīng)選用引物Me4Em3，反應(yīng)體系為20μL，內(nèi)含10×PCR buffer 2μL，DNA 濃度20ng，其余成分按照表1進(jìn)行，建立16個(gè)反應(yīng)組合。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min，反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min。之后35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃，最后延伸1min，72℃延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.8%瓊脂糖凝膠中，以0.5×TBE為電泳緩沖液電泳分離，最后用紫外成像系統(tǒng) (Tanon GIS一2009)觀察并成像 (見表1)。

表1 胡黃連SRAP L16(4)正交試驗(yàn)組合

1.4.3 引物篩選

引物采用Li和 Quiros［4］已發(fā)表的引物進(jìn)行兩兩配對(duì)，共產(chǎn)生30對(duì)引物組合，以隨機(jī)選取的胡黃連DNA作為模板，采用正交試驗(yàn)中初選出來的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4.4 退火溫度篩選

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了 30.0，30.2，30.9，32.0，33.2，34.4， 35.6， 36.8， 38.0， 39.1， 39.8，40.0℃共12個(gè)退火梯度，共進(jìn)行兩組PCR擴(kuò)增，第一組每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入1μL 5%的DMSO，第二組不加，作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件的建立

16個(gè)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果從圖1可以看出，6號(hào)以及9～16號(hào)無擴(kuò)增產(chǎn)物，其余均有擴(kuò)增產(chǎn)物。其中1，2，7，8號(hào)擴(kuò)增的條帶弱，3～5號(hào)條帶較清楚，但3號(hào)和5號(hào)擴(kuò)增條帶數(shù)少，均予以淘汰。只有4號(hào)所擴(kuò)增的條帶清晰且條帶數(shù)多。因此，確定16個(gè)組合中第4號(hào)組合的體系為最理想的SRAP－PCR反應(yīng)體系。

圖1 胡黃連正交試驗(yàn)擴(kuò)增圖

2.2 引物篩選

30條引物組合中有27條引物組合能夠擴(kuò)增出片段，這27條引物組合中，有13對(duì)引物組合的擴(kuò)增片段多、清晰、重復(fù)性較好 (見表2)，這13對(duì)引物組合可以作為胡黃連后續(xù)研究的引物。

表2 30對(duì)SRAP引物的篩選結(jié)果

2.3 退火溫度和圖譜背景優(yōu)化

從圖2可見，在30.0～40.0℃的退火溫度下，均有擴(kuò)增，且退火溫度越高，擴(kuò)增出的條帶越少，退火溫度在30.0～33.2℃范圍內(nèi)均擴(kuò)增出比較理想的帶型。在PCR反應(yīng)體系中添加5%DMSO和不加DMSO的兩組相比較，前者的圖譜背景比不加的要清晰。

圖2 不同退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響

3 討論

影響SRAP－PCR反應(yīng)的因素相對(duì)復(fù)雜，不同植物適合的SRAP反應(yīng)體系不同，且各因素之間存在互作效應(yīng)，4個(gè)因子之間的濃度配比只有達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)，才能得到穩(wěn)定的、可重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果［9］，本實(shí)驗(yàn)采用了一次正交實(shí)驗(yàn)，即建立了適合胡黃連的SRAP反應(yīng)體系:20μL反應(yīng)體系 (含10 × buffer)，dNTP150 μmol·L－1，Mg2+3.0 mmol·L－1，Taq 酶 2U，引物 0.5μmol· L－1，DNA 20ng。

Li和Quiros［4］的程序中，為了讓上、下游引物與DNA模板能部分配對(duì)，最初5個(gè)循環(huán)的退火溫度較低，設(shè)置為35℃，為了提高引物擴(kuò)增的特異性，后35個(gè)循環(huán)反應(yīng)的退火溫度升50℃。由于SRAP引物具有通用性，不同種植物所用的引物組合往往相同，因此擴(kuò)增程序差異不大。本研究對(duì)PCR結(jié)果影響較大的退火溫度進(jìn)行了梯度比較試驗(yàn)，篩選出了30.0～33.2℃的最佳退火溫度。

本研究對(duì)比了在瓊脂糖中添加終濃度5%的DMSO與對(duì)照組 (不加DMSO)對(duì)電泳圖譜背景清晰度的影響，結(jié)果顯示加入終濃度5%的DMSO的電泳圖譜的背景明顯清晰。據(jù)此確定SRAP反應(yīng)最終反應(yīng)體系為 20μL反應(yīng)體系 (含 10×buffer 2μL)，dNTP150μmol·L－1，Mg2+3.0mmol·L－1，Taq 酶 2U，引物 0.5μmol·L－1，DNA 20ng，1μ LDMSO，無菌水補(bǔ)齊，凝膠電泳時(shí)在瓊脂糖中添加5%的DMSO。

本實(shí)驗(yàn)建立了適用于胡黃連穩(wěn)定的、重復(fù)性強(qiáng)、中等產(chǎn)率的SRAP－PCR反應(yīng)體系，并對(duì)30條引物組合進(jìn)行了初步篩選，從30對(duì)引物組合中篩選到了13對(duì)擴(kuò)增片段多、清晰、重復(fù)性較好引物組合，結(jié)果為SRAP技術(shù)應(yīng)用到胡黃連的遺傳多樣性分析中奠定了基礎(chǔ)。

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