王建鋒，駱健美，宋 妍，劉 洋，鄭 宇，王 敏

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

甾體的C1，2位脫氫是糖皮質(zhì)激素合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。通常甾體脫氫衍生物在生理活性上要強(qiáng)于其前體，具有更好的抗炎和抗過敏活性，且副作用更小。自然界中許多微生物都具有C1，2位脫氫能力，其中簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)以專一性高等優(yōu)點(diǎn)成為研究和應(yīng)用廣泛的菌株[1，2]。簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的轉(zhuǎn)化過程中需要加入有機(jī)溶劑以增加底物的溶解度，促進(jìn)酶和底物的充分接觸，從而提高反應(yīng)效率。目前，乙醇以其毒性低、污染小、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用[3]。

目前，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌C1，2位脫氫反應(yīng)的研究多集中在有機(jī)溶劑的選擇[4]、工藝條件的優(yōu)化[5]和脫氫動(dòng)力學(xué)研究[6]。2009年，別松濤等[7]以菌體的糖代謝活力保留值表征多種有機(jī)溶劑對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的毒性，該指標(biāo)只是反映了細(xì)胞代謝活力的變化，而有機(jī)溶劑添加后對(duì)細(xì)胞性質(zhì)的影響是非常復(fù)雜的[8]，需要從多方面進(jìn)行考察。

作者從菌體生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)、耗糖能力、跨膜電位和膜通透性等方面研究乙醇對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)和細(xì)胞性質(zhì)的影響，擬為深入了解有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞生物學(xué)活性的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)、也為毒性機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院微生物制藥研究室保存。

斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和菌體培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[9]配制。

無水乙醇、甲醇，天津市立元化工有限公司；羅丹明123(Rh123)、二乙酸熒光素(FDA)，德國(guó)默克公司；其它藥品均為市售分析純。

JSPM-5200型原子力顯微鏡；YJ-875S型醫(yī)用凈化臺(tái)；WS2-134-75型電熱恒溫培養(yǎng)箱；GB204型電子分析天平；Gilson微量取樣器； RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)；SBA-90型生物傳感儀；UVmini-1240型紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

30℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2 種子培養(yǎng)

從斜面上挑取活化后的ArthrobactersimplexTCCC 11037菌種1環(huán)，接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培養(yǎng)18 h，此時(shí)菌體OD600為0.8。

1.2.3 菌體培養(yǎng)

按5%的接種量將種子液接種于裝有30 mL菌體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培養(yǎng)。菌體培養(yǎng)時(shí)根據(jù)需要添加不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇。

1.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

菌體培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后32℃、160 r·min-1培養(yǎng)32 h，每隔4 h取樣。通過平板活菌計(jì)數(shù)法確定添加不同體積分?jǐn)?shù)乙醇后菌體的生長(zhǎng)量，比生長(zhǎng)速率的計(jì)算參照文獻(xiàn)[10]。其中，未添加乙醇的菌體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行樣。

1.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響

菌體培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)為0%、2%、5%、8%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1培養(yǎng)24 h。5000 r·min-1離心收集菌體，并用無菌水洗滌2次，將細(xì)胞于2.0%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱內(nèi)過夜。將細(xì)胞濃度調(diào)至相同(OD600為0.6)，取少量菌懸液于蓋玻片上，晾干，原子力顯微鏡檢測(cè)。成像在大氣環(huán)境下進(jìn)行，掃描模式為輕敲模式，所有圖像均通過自動(dòng)平滑和低通濾波處理以消除慢掃方向的低頻噪音，選擇5 μm視野進(jìn)行觀察。

1.2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體耗糖能力的影響

菌體培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1培養(yǎng)32 h，每隔約4 h取樣1 mL，稀釋20倍后用生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛?。其中，未添加乙醇的菌體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行樣。

1.2.7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體細(xì)胞膜跨膜電位和通透性的影響

菌體培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接種后于32℃、160 r·min-1共同培養(yǎng)24 h，取10 mL培養(yǎng)液5000 r·min-1離心，生理鹽水洗滌2次后重懸，將菌體的OD600值均調(diào)至0.8(此時(shí)細(xì)胞濃度約為1×107cfu·mL-1)。細(xì)胞膜跨膜電位的測(cè)定采用Rh123熒光法[11]，膜通透性的測(cè)定采用FDA熒光法[11]。其中，未添加乙醇的菌體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌生長(zhǎng)的影響(圖1、圖2)

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)過程中，乙醇的加入對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定影響。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌體生長(zhǎng)的延滯期明顯延長(zhǎng)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到6%時(shí)，24 h的生長(zhǎng)量與培養(yǎng)初期基本上一致，即仍處于延滯期。另外，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體生長(zhǎng)量有明顯的抑制作用，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，菌體量為1.9×109cfu·mL-1，僅為對(duì)照組的14.84%，之后繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)到6%，菌體幾乎未見明顯生長(zhǎng)。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的比生長(zhǎng)速率

由圖1和圖2可知，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的初始生長(zhǎng)速率和比生長(zhǎng)速率均隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而下降。當(dāng)添加1%乙醇時(shí)，菌體的比生長(zhǎng)速率為0.2662 h-1，添加3%乙醇時(shí)為0.1550 h-1，分別比對(duì)照組(0.3479 h-1)下降了23.49%和55.45%；繼續(xù)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，菌體比生長(zhǎng)速率繼續(xù)下降但變化不大，維持在0.0680～0.0419 h-1的較低水平，僅為對(duì)照組的19.54%～12.04%。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌超顯微結(jié)構(gòu)的影響(圖3)

圖3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的超顯微結(jié)構(gòu)

由圖3可知，在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)過程中，隨著添加乙醇的體積分?jǐn)?shù)逐步增大，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較明顯變化。對(duì)照菌體的細(xì)胞形狀較規(guī)則，近短桿形，細(xì)胞膜光滑完整；2%乙醇組的細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則的形狀，兩端有向上翹起的趨勢(shì)，細(xì)胞長(zhǎng)徑減小，部分有凹陷；5%乙醇組的細(xì)胞體積明顯增大，部分細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，細(xì)胞表面較對(duì)照組粗糙；8%乙醇組的細(xì)胞形狀極不規(guī)則，細(xì)胞發(fā)生明顯的胞漿外泄，完整性受到明顯破壞。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌耗糖能力的影響(圖4)

圖4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的耗糖情況

由圖4可知，在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)過程中，乙醇的加入對(duì)菌體的耗糖能力產(chǎn)生了一定的抑制作用，耗糖速率和耗糖量隨著添加的乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大均呈明顯下降趨勢(shì)。添加3%乙醇菌體生長(zhǎng)到20 h和32 h時(shí)，培養(yǎng)液中的殘?zhí)菨舛确謩e下降了2.5 g·L-1和4.2 g·L-1，為對(duì)照組耗糖量的37.88%和55.26%。添加6%乙醇菌體生長(zhǎng)到20 h時(shí)，菌體的耗糖量?jī)H為0.3 g·L-1，延長(zhǎng)培養(yǎng)至32 h，菌體的耗糖量仍維持在較低水平，僅為0.7 g·L-1，是對(duì)照組耗糖量的9.21%，說明添加6%乙醇時(shí)菌體耗糖能力幾乎完全受到抑制。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌跨膜電位和通透性的影響(圖5)

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037跨膜電位和通透性的影響

由圖5可知，在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)過程中，菌體的跨膜電位隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，Rh123熒光強(qiáng)度為對(duì)照組的85.86%，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大到6%時(shí)，僅為對(duì)照組的75.42%。一般認(rèn)為，菌體跨膜電位的下降說明細(xì)胞自身生命活力的減弱[12]。由圖3可知，這種細(xì)胞活力的減弱可能是因?yàn)楦唧w積分?jǐn)?shù)乙醇存在下細(xì)胞完整性受到破壞，胞漿大量外泄造成的。

細(xì)胞膜的通透性隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大表現(xiàn)出增大的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，F(xiàn)DA熒光強(qiáng)度為對(duì)照組的106.58%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大到6%時(shí)，為對(duì)照組的118.37%。這說明隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，細(xì)胞膜的通透性增大，有機(jī)溶劑在細(xì)胞膜內(nèi)積累濃度的增大是抑制菌體生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的重要原因[8]。

3 結(jié)論

(1)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)由1%逐步遞增到6%，菌體延滯期相應(yīng)不斷延長(zhǎng)，菌體生物量和菌體的比生長(zhǎng)速率呈逐步下降趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的延滯期延長(zhǎng)到了16 h，生長(zhǎng)量為對(duì)照組的14.84%，比生長(zhǎng)速率下降為對(duì)照組的44.55%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，幾乎觀察不到明顯的菌體生長(zhǎng)。

(2)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037細(xì)胞完整性的影響。原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的細(xì)胞形狀較規(guī)則，近短桿形，細(xì)胞膜光滑完整。實(shí)驗(yàn)組菌體主要呈短桿狀和球狀，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面不平整，菌體形態(tài)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大出現(xiàn)顯著改變，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)，出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞破損和胞漿外泄，細(xì)胞完整性明顯破壞。

(3)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)簡(jiǎn)單節(jié)桿菌TCCC 11037的耗糖能力、跨膜電位和通透性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，菌體的耗糖能力受到抑制，菌體生長(zhǎng)到32 h時(shí)，對(duì)照組和3%乙醇添加組中的葡萄糖濃度由9.8 g·L-1分別下降到2.2 g·L-1和5.6 g·L-1，在6%乙醇下，培養(yǎng)基中的葡萄糖幾乎沒有明顯消耗。利用Rh123法和FDA法分別考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌體跨膜電位和通透性的影響，結(jié)果表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，跨膜電位下降，細(xì)胞膜通透性增大。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，跨膜電位下降14.14%，細(xì)胞膜通透性增加6.58%；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，跨膜電位下降24.58%，細(xì)胞膜通透性增加18.37%。

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