范步高

(上海長征富民金山制藥有限公司上海201506)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。所含的化學(xué)成分主要有兩大類:水溶性的酚酸類化合物和脂溶性的丹參酮類化合物［1］，在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的丹參類注射劑中，大多是以酚酸類化合物為指標(biāo)成分［2］，其中丹參素(丹參素鈉)具有抗血栓、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等明顯的藥理活性［3-5］，隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對丹參的有效成分也有了更深一步認識，并確認了丹酚酸B是較丹參素活性更強的丹參酚酸類有效成分，并在丹參功效中占有相當(dāng)重要地位，對心、腦、肝、腎等多個器官均具有保護作用，具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化、抗心肌缺血及調(diào)血脂作用、清除自由基作用、內(nèi)皮素和釋放作用、鈣通道阻滯作用、TXA2/PG12平衡調(diào)節(jié)劑作用等［6-8］。

丹參酚酸類有效成分的提純一般采用傳統(tǒng)的水提醇沉法［2］，但有效成分極易被沉淀的“雜質(zhì)”所包裹。本文推薦簡便易行的用相同濃度的乙醇對醇沉渣再提取被包裹的有效成分，以提高產(chǎn)品有效成分的含量和保證臨床使用療效。

1 丹參注射液酚酸類有效成分的提取現(xiàn)狀

水提醇沉法，其原理即是利用經(jīng)水提取的(酚酸類)有效成分既能溶于水又能溶于乙醇，而淀粉、無機鹽、多糖、蛋白質(zhì)等“雜質(zhì)”則將會隨著乙醇的不斷加入而逐漸被析出、沉淀［9］。但酚酸類有效成分的損失也將隨著醇濃度增高而增加，有較多學(xué)者都認為丹參水提液的醇沉最佳醇濃度為50% ～60%［10-15］(見表1)，而用于注射液的丹參二次醇沉最佳含醇量分別為①60%，②70%［16］。王曉泊等為提高注射用丹參成品收率及有效成分的相對含量，用大孔吸附樹脂對經(jīng)二次醇沉(含醇量分別為①60%，②85%)的醇沉渣進行了回收，結(jié)果使成品收率增加了14.03%，丹參素鈉相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長了15.75%，總酚酸相對含量增加了22.46%［17］，這也充分說明了在丹參醇沉過程中，確有較多量的有效成分損失在醇沉渣中。而在丹參類注射液現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)［2，18-19］中，丹參的二次醇沉的含醇量均分別為①75%和②85%，所以，丹參的有效成分損失更大，但國家標(biāo)準(zhǔn)中的醇沉濃度屬于純化關(guān)鍵參數(shù)，不得隨意變更。所以，再加之藥材質(zhì)量和操作水平的差異，丹參成品質(zhì)量的波幅也隨之成倍加大［20］(見表2)。

表1 不同醇沉工藝的有效成分量損失率/%

表2 同一廠家不同批號及不同廠家丹參注射液含量測定結(jié)果(n=8)

2 材料與方法

2.1 實驗器材及試劑 w501升降恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)，SY3200超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)，DS-671電子秤(上海寺岡電子有限公司)，高效液相色譜儀(安捷倫1100)，紫外分光光度儀(島津UV-2401PC)，75%醇沉渣(上海長征富民金山制藥有限公司080601丹參提取)，乙醇(丹參醇沉液濃縮回收)。

2.2 檢測方法

2.2.1 丹參素鈉、原兒茶醛、總酚測定依據(jù)丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［2］進行測定。

2.2.2 丹酚酸B測定照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥD)測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動相A，0.03%磷酸水溶液為流動相B，按表3進行梯度洗脫;體積流量為0.8 mL/min，柱溫:30℃;檢測波長:288 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計算應(yīng)不低于10000。

表3 丹酚酸B檢測梯度洗脫

對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加10%甲醇制成每1 mL含丹酚酸 B 0.1 mg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液的制備 取提取液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5～10 μL，注入液相色譜儀，測定，按峰面積用外標(biāo)法計算其含量。

2.3 再提取工藝 取丹參75%醇沉渣(含量折算約3.1 g生藥/g渣)適量，加入3倍量(mL/g)75% ～76%乙醇，50～60℃水浴，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)和超聲波清洗器超聲各1 h，放冷，取上清液，檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、總酚量。

3 結(jié)果

75%醇沉渣再提取液含量檢測結(jié)果(見表4)同批次醇沉液制成品n=3。

表475 %醇沉渣再提取液含量檢測結(jié)果(mg/g生藥)(n=3)

4 討論

由表4可看出，丹參75%醇沉渣中有較多的有效成分被損失，可以最簡便易行的方法再提取，特別是對丹酚酸B(丹酚酸B在后續(xù)的濃縮和滅菌等高溫操作中有較大部分水解成丹參素鈉和原兒茶醛［21］)。綜合考慮3個有效成分和總酚，旋轉(zhuǎn)和超聲的效果相近。若應(yīng)用于生產(chǎn)，則可參照旋轉(zhuǎn)的方式，利用原有的醇沉罐生產(chǎn)設(shè)備，攪拌提取，液固接觸更完全，被包裹的有效成分的“轉(zhuǎn)溶”效果則會更佳。

選擇75%醇沉渣進行再提取，是因為(第一次)75%醇沉的有效成分損失大于(第二次)85%醇沉的有效成分損失。若有操作不當(dāng)，如濃縮液的相對密度較大或醇沉用的乙醇濃度過高，則(第二次)85%醇沉有效成分損失較多時，也可對85%醇沉渣進行再提取。

采用相同濃度的乙醇對醇沉渣再提取，除簡便易行外，另一最主要考量是此操作完全在法定的標(biāo)準(zhǔn)制法框架下、未涉及工藝改變，并能夠及時將再提取液進行同批次合并進入下道工序，完全符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的要求，且又不影響生產(chǎn)周期。

據(jù)查詢SFDA(國家食品藥品監(jiān)督管理局)數(shù)據(jù)庫，目前SFDA頒布的丹參注射液生產(chǎn)批文有101張，香丹注射液(復(fù)方:丹參、降香)生產(chǎn)批文也有165張，他們均屬“老”產(chǎn)品，由于原研時期的研究和檢測水平的限制等歷史原因，在最早的1977年版中國藥典(丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))及以后的各地方標(biāo)準(zhǔn)中，均無丹參有效成分含量的檢測要求［22-26］。1998年國家衛(wèi)生部頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)僅增加了對原兒茶醛有效成分含量的檢測［18-19］，直至2002年國家藥品監(jiān)督管理局頒布的“地標(biāo)升國標(biāo)”藥品標(biāo)準(zhǔn)中的丹參類注射液或滴注液又增加了對丹參素鈉有效成分含量及總酚的檢測［2］。但在所有這些注射劑的標(biāo)準(zhǔn)處方中，都遵循了傳統(tǒng)的一帖一煎中藥處方模式，即均是以中藥材作為注射劑的投料依據(jù)，規(guī)定了每1000 mL注射劑所需藥材投入量，未及考慮中藥材的采集地點、采收時間的不同，所富集的有效成分會有較大差異［27-29］，再加之提取設(shè)備型號的不同、操作人員對關(guān)鍵工序掌握的經(jīng)驗差異等，也均會對提取質(zhì)量產(chǎn)生很大的差異。所以，雖然生產(chǎn)出的成品(見表2)都能符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最低要求，但可控性較差，故造成企業(yè)內(nèi)或企業(yè)間產(chǎn)品的實際質(zhì)量差異很大，使得臨床應(yīng)用中的療效也隨之產(chǎn)生很大波動。系統(tǒng)的解決辦法之一是依據(jù)現(xiàn)有的相對優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品為依據(jù)，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。二是隨著研究的深入和檢測水平的提高，完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。三是改變處方投料依據(jù)，減少藥材提取和純化的中間不確定性環(huán)節(jié)，即改變原中藥注射劑以中藥材投料控制為中藥標(biāo)準(zhǔn)提取物投料控制，以保證中藥注射劑或其他中藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、可控和臨床使用療效。而本文推薦的用相同濃度的乙醇對醇沉渣進行“洗滌”再提取被包裹的有效成分，僅是在先行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的框架下，為提高丹參產(chǎn)品的有效成分含量，保證臨床使用療效的一種簡便易行、具有較高生產(chǎn)應(yīng)用價值的實用方法。

致謝:本實驗檢測工作由本公司質(zhì)檢科倪慧芳技師幫助完成。

［1］宋紀(jì)元.丹參［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001:60-65.

［2］國家藥品監(jiān)督管理局.國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編［S］.心系分冊.2002.

［3］張 興.丹參藥理研究進展［J］.基層中藥雜志，2004，14(4):47-48.

［4］李艷杰，孫玉華.丹參素藥理作用研究進展［J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2006，29(1):73-75.

［5］楊繼英，鄭 軍.丹參素的藥理作用研究進展［J］.中華臨床醫(yī)學(xué)雜志，2007，8(4):45-47.

［6］尹 英，王 峰.丹酚酸B研究進展［J］.中國藥師，2007，10(10):1034-1036.

［7］湛月娥.丹酚酸B藥理作用的研究進展［J］.華南國防醫(yī)學(xué)雜志，2007，21(2):37-39.

［8］杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分——丹酚酸研究進展［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20(5):10-14.

［9］趙陸軍，徐思康，張保獻.中藥水提取液常用精制方法概述［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，7(11):47-48.

［10］李淑莉，丁安榮.沉淀工序乙醇濃度對丹參素回收率影響的研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，25(12):529-531.

［11］張 玲，徐興剛，楊少延，等.醇沉濃度對丹參中原兒茶醛含量的影響［J］.中藥材，1995，18(2):96-97.

［12］張 玲，于宗淵，徐新剛，等.丹參水醇法提取工藝的研究［J］.中成藥，1995，17(5):1-3.

［13］顧 娟，羅海燕，安蓮英，等.丹參酚酸水提取工藝的研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(6):781-783.

［14］李淑莉，歐興長，丁安榮，等.不同濃度乙醇沉淀對丹參素回收率影響的研究［J］.基層中藥雜志，1995，9(1):21-22.

［15］王志平，范晉勇，劉玉強，等.丹參提取液的樹脂吸附及醇沉工藝對比研究［J］.離子交換與吸附，2003，19(6):554-560.

［16］李 蓉，畢 華.復(fù)方丹參注射液制備工藝中丹參提取工藝的研究［J］.醫(yī)學(xué)理論與實踐，2006，19(6):727-739.

［17］王曉泊，張 翠，劉 穎，等.注射用丹參提取工藝的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥，2008，21(2):42-43.

［18］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3—B—3289—98，香丹注射液［S］.

［19］衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) WS3—B—3766—98，丹參注射液［S］.

［20］黃趙剛，劉 鋼，夏 泉，等.HPLC法測定不同廠家丹參注射液中丹參素和原兒茶醛的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(11):1055-1056.

［21］徐德然，王康才，王崢濤，等.丹參中丹參素、原兒茶醛來源的初步研究［J］.中國天然藥物，2005，3(3):148-150.

［22］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:1977年版一部［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1978:115.

［23］上海市藥品標(biāo)準(zhǔn)滬Q/WS-1-974-80，復(fù)方丹參注射液［S］.

［24］河北省藥品標(biāo)準(zhǔn)冀/WS-BZ-215-91，復(fù)方丹參注射液［S］.

［25］浙江省藥品標(biāo)準(zhǔn)DB33/WS-244-83-93，復(fù)方丹參注射液［S］.

［26］河北省藥品標(biāo)準(zhǔn)冀/WS-BZ-85-91，丹參注射液［S］.

［27］安 蕓，張樂青，苗 芳，等.不同產(chǎn)地丹參水溶液有效成分的比較研究［J］.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校學(xué)報，2008，20(2):67-68.

［28］李正國，于立佐.不同采收期山東產(chǎn)丹參脂溶性成分含量變化的研究［J］.齊魯藥事，2007，26(7):401-402.

［29］姜衛(wèi)衛(wèi)，張永清，李 佳.丹參最佳采收期初討［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2008，22(1):12-14.