余 倩

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東 廣州 510225 2.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510275)

桿狀病毒是一類節(jié)肢動(dòng)物專一性的病毒，它們帶有桿狀的核衣殼，基因組是由大小約為80～180 kb雙鏈環(huán)狀DNA所構(gòu)成[1]。桿狀病毒的宿主范圍窄，大部分桿狀病毒只能感染幾種昆蟲甚至是專一性的一種。

桿狀病毒生活周期主要分為以下幾步：進(jìn)入細(xì)胞、早期基因表達(dá)、DNA的復(fù)制、晚期基因表達(dá)、極晚期基因表達(dá)、芽生型病毒(budded virus, BV)的組裝和釋放、核多角體蛋白包含體(occlusion-derived virus, ODV)的形成。

斜紋夜蛾核多角體病毒(Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltNPV)和甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodopteraexiguamultiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)的全基因組已完成測(cè)序[2-3]，兩者的基因組相似性程度高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)兩者不能交叉感染各自宿主，SeMNPV感染SpLi-221細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞凋亡[4]，而SpltNPV感染Se301細(xì)胞的研究還未見報(bào)導(dǎo)。為了了解SpltNPV感染Se301細(xì)胞的進(jìn)程并尋找病毒感染失敗的原因，本研究對(duì)SpltNPV感染后的Se301細(xì)胞進(jìn)行了生化分析，發(fā)現(xiàn)病毒蛋白表達(dá)受阻是SpltNPV感染Se301細(xì)胞失敗的主要原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲細(xì)胞與病毒 野生型SpltNPV中山大學(xué)分離株(ZSU strain)由本實(shí)驗(yàn)室保存。SeMNPV-SeUS1引自美國(guó)加州大學(xué)Riverside分校B.A.Federici教授實(shí)驗(yàn)室。甜菜夜蛾細(xì)胞Se301由荷蘭Wageningen大學(xué)J.M.Vlak教授惠贈(zèng)，用w=10 %胎牛血清的Grace′s培養(yǎng)基 (Invitrogen) 27 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 供試?yán)ハx 斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲由本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲室提供，為人工飼料飼養(yǎng)的健康幼蟲。人工飼料配方見參考資料[5]，飼養(yǎng)溫度 27～28 ℃。

1.2 方法

1.2.1 病毒多角體擴(kuò)增 將病毒多角體涂布于人工飼料表面喂飼感染4齡初的昆蟲幼蟲，感染4～5 d后收集呈現(xiàn)典型病毒感染癥狀的幼蟲(蟲體倒掛，身體腫脹，呈灰白色)，置室溫下靜置2至3天讓其自然發(fā)酵(病毒進(jìn)一步成熟和蟲體進(jìn)一步液化)。用10倍的PBS懸浮發(fā)酵的蟲尸，經(jīng)四層紗布過濾，濾液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，沉淀物重懸于適量PBS中，600 r/min離心5 min，收集上清。如此重復(fù)3～4次，直至多角體懸浮液呈乳白色，光學(xué)顯微鏡檢查在多角體懸液中雜質(zhì)很少，即為較純的病毒多角體。

1.2.2 病蟲血淋巴制備 用多角體喂飼感染四齡初昆蟲幼蟲,感染3 d后經(jīng)鏡檢有極少量多角體出現(xiàn)即取血淋巴。用φ=70 %乙醇將病蟲表面消毒，剪開腹足，血淋巴滴入含w=0.1 %苯基硫脲的Grace′s 培養(yǎng)基中，3 000 r/min離心10 min，除去血淋巴細(xì)胞，取上清經(jīng)過濾滅菌保存，供細(xì)胞感染用。

1.2.3 在離體培養(yǎng)細(xì)胞中增殖病毒 吸盡單層培養(yǎng)細(xì)胞中培養(yǎng)液，按感染復(fù)數(shù)(MOI)大約為1的接種量接種病毒血淋巴，室溫吸附1 h，吸棄病毒液，以無抗生素?zé)o血清Grace′s培養(yǎng)基洗2次，然后加入新鮮Grace′s培養(yǎng)基，27 ℃培養(yǎng)72 h～96 h左右，收集細(xì)胞上清，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4SpltNPV 病毒感染細(xì)胞 在35 mm培養(yǎng)皿中以0.5×106個(gè)細(xì)胞/孔密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Se301細(xì)胞；貼壁1 h后，移出培養(yǎng)基，SpltNPV病毒以MOI為1感染細(xì)胞，27 ℃培養(yǎng)1 h并間隔搖動(dòng)培養(yǎng)板；1 h后棄感染液，以無抗生素?zé)o血清Grace′s培養(yǎng)基洗2次，然后加入Grace′s培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，加入病毒即開始計(jì)時(shí)，于感染后不同時(shí)間收集取樣，3 000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀先放入液氮速凍30 min，再放入-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Dot Blotting 收取感染后細(xì)胞樣品提取總DNA融于8 mmol/L NaOH，調(diào)整至終濃度100 μg/mL，測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品取10 μL，100 ℃煮5 min，冰上迅速冷卻。于Dot Blotting裝置上點(diǎn)樣轉(zhuǎn)膜。方法參照Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus(Bio-Rad, Inc)操作手冊(cè)。主要步驟包括：DNA固定，探針制備和標(biāo)記，地高辛雜交，雜交后洗膜，檢測(cè)和顏色反應(yīng)。

1.2.6 RT-PCR RT-PCR反應(yīng)按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作手冊(cè)進(jìn)行。 取反應(yīng)液5 μL進(jìn)行凝膠電泳，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。以RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)模板是否存在DNA污染。所用引物序列見表1，引物由上海英駿生物工程公司合成。

1.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 收集細(xì)胞上清，加等量的2×蛋白上樣緩沖液，于沸水中煮5～10 min，按常規(guī)方法在Bio-Rad小型蛋白電泳儀上進(jìn)行恒流電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色后用脫色液進(jìn)行脫色，觀察蛋白帶型。

1.2.8 Western blotting 收集病毒感染后細(xì)胞，PBS緩沖液洗2次，細(xì)胞裂解后進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，蛋白封閉，以制備的POLYHEDRIN多克隆抗體為一抗1∶500稀釋后進(jìn)行western blotting檢測(cè)，觀察蛋白表達(dá)情況。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

2 結(jié) 果

2.1 SpltNPV感染Se301細(xì)胞后DNA復(fù)制情況

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)SpltNPV不能成功感染Se301細(xì)胞，而是誘導(dǎo)Se301細(xì)胞產(chǎn)生凋亡(資料未顯示)。為研究SpltNPV在Se301凋亡細(xì)胞中的感染進(jìn)程以及病毒感染失敗的原因，首先進(jìn)行dot blotting分析檢測(cè)病毒復(fù)制，正常Se301樣品為陰性對(duì)照，SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞為陽性對(duì)照，雜交探針為DIG標(biāo)記的病毒polyhedrin基因(polyhedrin-dig), 標(biāo)準(zhǔn)樣品(Marker)為polyhedrin的PCR產(chǎn)物。檢測(cè)結(jié)果顯示：陽性對(duì)照樣品在感染后12 h能檢測(cè)到有病毒復(fù)制，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)病毒量越來越多；SpltNPV感染Se301細(xì)胞樣品中從12 ～72 h也能檢測(cè)到病毒復(fù)制，但病毒復(fù)制的速度明顯低于SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞的復(fù)制速度，此結(jié)果說明SpltNPV感染Se301細(xì)胞后完成了病毒的復(fù)制但復(fù)制速度受到一定影響。

圖1 SpltNPV感染SpLi-221或Se301細(xì)胞的Dot blotting分析

2.2 SpltNPV在Se301細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)相

病毒基因的轉(zhuǎn)錄分為極早期、早期、晚期和極晚期。極早期基因在感染后1h就能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄，感染后6 h之前轉(zhuǎn)錄的基因?yàn)樵缙诨颍腥竞?h之后轉(zhuǎn)錄的基因?yàn)橥砥诨?，且感染?2 h之后轉(zhuǎn)錄的基因?yàn)闃O晚期基因。SpltNPV病毒在Se301細(xì)胞中進(jìn)行了病毒的復(fù)制，可以推測(cè)病毒的早期基因應(yīng)該進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)，下一步需了解病毒的晚期基因是否得到了轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而可進(jìn)一步驗(yàn)證早期基因是否得到了轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，現(xiàn)采取RT-PCR分析病毒在Se301細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄情況。設(shè)計(jì)3對(duì)引物以SpltNPV基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，首先需鑒定引物是否正確(圖2)，結(jié)果顯示3對(duì)引物都能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的條帶，說明設(shè)計(jì)引物無誤。

圖2 ieo、DNA polymerase、chitnase基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

為確定SpltNPV病毒在Se301細(xì)胞中是否完成了轉(zhuǎn)錄，以及各基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間與SpltNPV病毒在受納細(xì)胞SpLi-221細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)間是否一致，進(jìn)行病毒基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析。結(jié)果如圖3顯示：SpltNPV感染Se301細(xì)胞1 h后能檢測(cè)到很微弱的ieo轉(zhuǎn)錄本，從4 h至48 h均能檢測(cè)到ie0的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本；DNApolymerase基因從6～48 h能檢測(cè)到強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本；從8～48 h能檢測(cè)到chitnase的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本?？偟膩碇v，SpltNPV感染Se301細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相與SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相基本一致，只是極早期基因ie0至晚期也有轉(zhuǎn)錄。

2.3 SpltNPV在Se301細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

SpltNPV感染Se301細(xì)胞后病毒的所有基因都得到了轉(zhuǎn)錄，病毒蛋白的表達(dá)情況又如何？采取SDS-PAGE和Western blotting分析檢測(cè)病毒感染Se301細(xì)胞后其蛋白的表達(dá)情況。由于光鏡觀察SpltNPV感染Se301細(xì)胞48 h時(shí)有明顯病理癥狀(資料未顯示)，所以收取Se301細(xì)胞樣品和SpltNPV感染Se301細(xì)胞48 h樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析比較；Se301細(xì)胞為SpltNPV的非受納細(xì)胞，感染進(jìn)程可能與SpltNPV感染受納細(xì)胞SpLi-221不同，所以收取SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞24、48和72 h (圖4所示)樣品與SpltNPV感染Se301細(xì)胞48 h樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析比較。結(jié)果顯示：SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞無論在24、48和72 h樣品中很明顯都有一條29 700的POLYHEDRIN條帶，且總蛋白表達(dá)條帶在24、48和72 h沒有明顯區(qū)別；而正常的Se301細(xì)胞和SpltNPV感染Se301細(xì)胞48 h樣品中沒有此條帶；對(duì)正常Se301細(xì)胞和SpltNPV感染Se301細(xì)胞48 h樣品的總蛋白帶型進(jìn)行比較，觀察不到蛋白帶型明顯的區(qū)別。所以SpltNPV感染Se301細(xì)胞后蛋白表達(dá)受到了一定程度的限制，極晚期基因polyhedrin的表達(dá)受阻。

圖3 RT-PCR分析ieo、DNA polymerase、 chitnase基因的轉(zhuǎn)錄

圖4 SpltNPV感染Se301細(xì)胞SDS-PAGE分析

用極晚期基因polyhedrin的多克隆抗體對(duì)SpltNPV感染Se301細(xì)胞24、48、72 h樣品進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果如圖5表明細(xì)胞被感染24，48，72 h極晚期基因polyhedrin沒有表達(dá)。總的來講SpltNPV感染Se301細(xì)胞后其蛋白表達(dá)受阻，以至于不能完成整個(gè)的病毒復(fù)制。

圖5 SpltNPV感染Se301細(xì)胞polyhedrin基因Western blotting分析

3 討 論

SpltNPV和SeMNPV基因組相似性很高,但這兩種病毒不能交叉感染各自宿主。先前研究表明細(xì)胞凋亡是限制桿狀病毒感染昆蟲的主要原因之一，早有關(guān)于桿狀病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而導(dǎo)致病毒感染失敗的報(bào)導(dǎo)，如HycuNPV誘導(dǎo)的Ld652Y細(xì)胞凋亡[6]；HaSNPV誘導(dǎo)的Hi5和s1-zsu-1細(xì)胞凋亡[7-8]；SeMNPV感染SpLi-221細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞凋亡；SpltNPV感染Se昆蟲也可誘導(dǎo)昆蟲體液細(xì)胞凋亡[9]，且本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)SpltNPV感染Se301細(xì)胞也誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。

桿狀病毒生活周期主要分為以下幾步：進(jìn)入細(xì)胞、早期基因表達(dá)、DNA的復(fù)制、晚期基因表達(dá)、極晚期基因表達(dá)、BV的組裝和釋放、核多角體蛋白包含體的形成。SpltNPV不能成功感染Se301細(xì)胞產(chǎn)生子代病毒，即Se301細(xì)胞為SpltNPV的非受納細(xì)胞。

研究顯示SpltNPV感染Se301細(xì)胞后病毒完成了整個(gè)DNA復(fù)制過程，但DNA復(fù)制量明顯低于SpltNPV感染其原宿主細(xì)胞SpLi-221細(xì)胞的DNA復(fù)制量，分析其原因可能是由于病毒感染其非受納宿主細(xì)胞感染進(jìn)程受阻。DNA復(fù)制之前是病毒早期基因的表達(dá)，研究證實(shí)桿狀病毒誘導(dǎo)的凋亡可由感染早期的事件所引起[10]，先前研究表明病毒的極早期基因ie1能引起由AcMNPV誘導(dǎo)的Sf21細(xì)胞凋亡[11]。 本研究中ie0基因的表達(dá)也可能會(huì)引起細(xì)胞凋亡，使得大部分病毒感染失敗，只有少量病毒能完成DNA復(fù)制，所以觀察到病毒感染受納和非受納細(xì)胞DNA復(fù)制速度不同。

病毒轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析結(jié)果表明病毒的所有基因都完成了轉(zhuǎn)錄，且早期基因和晚期基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)相與SpltNPV感染其原宿主的轉(zhuǎn)錄時(shí)相一致，符合桿狀病毒感染其原宿主的一般轉(zhuǎn)錄時(shí)相規(guī)律，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)極早期基因ie0的轉(zhuǎn)錄在1 h時(shí)較正常原宿主感染量弱，且基因轉(zhuǎn)錄延遲到了感染后期即24 h以后。一般的極早期基因轉(zhuǎn)錄只在感染的早期出現(xiàn)，到感染后期沒有極早期基因的轉(zhuǎn)錄，可能由于病毒感染進(jìn)程不一致，導(dǎo)致一部分病毒進(jìn)入感染晚期而一部分病毒還處于其它感染階段。

經(jīng)檢測(cè)Se301細(xì)胞與SpltNPV感染Se301細(xì)胞的總蛋白表達(dá)情況沒有明顯不同，且與SpltNPV感染SpLi-221細(xì)胞總蛋白表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SpltNPV感染Se301細(xì)胞中無極晚期POLYHEDRIN蛋白的表達(dá)，Western blotting檢測(cè)結(jié)果與上述結(jié)果一致，說明病毒的蛋白表達(dá)受到了一定程度的限制，極晚期基因的表達(dá)受阻。

綜合以上分析結(jié)果，病毒進(jìn)入細(xì)胞首先進(jìn)行早期基因表達(dá)，可能因?yàn)樵缙诨虻谋磉_(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，所以大部分病毒感染失敗，只有少量病毒進(jìn)行DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，DNA復(fù)制后病毒隨即進(jìn)行晚期或極晚期基因表達(dá)[12]，由于某種未知原因，也可能是其它因素誘導(dǎo)了細(xì)胞發(fā)生凋亡，病毒晚期基因的表達(dá)受到抑制以至不能完成BV的裝配和產(chǎn)生子代病毒?？偟膩碚f，病毒蛋白表達(dá)受阻是SpltNPV在Se301細(xì)胞中無法形成子代病毒，完成整個(gè)病毒復(fù)制的主要原因，本研究為深入研究其感染失敗機(jī)理奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

致謝本研究在中山大學(xué)龐義教授和楊凱教授的指導(dǎo)和幫助下完成，謹(jǐn)以感謝。

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