平海林，吳金英，徐勝威，胡開(kāi)順，段志剛

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所∥廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)主要由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血小板產(chǎn)生[1]，能參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，例如細(xì)胞增殖、分化、存活、遷移以及免疫細(xì)胞的活化和失活等[2]。進(jìn)化研究表明，TGF-β基因相當(dāng)保守，其配體、受體和與家族蛋白有關(guān)的信號(hào)分子在節(jié)肢動(dòng)物中也存在，表明該基因在10億年前就已存在[3]。哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)TGF-β有3種異構(gòu)體：TGF-β1、2、3，其中TGF-β1在所有免疫細(xì)胞中都有所表達(dá)，并在出現(xiàn)各種壓力和多種疾病信號(hào)后，參與細(xì)胞反應(yīng)[4]。如阻斷免疫細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致疾病，并伴隨慢性炎癥的纖維化過(guò)程[5]，寄生蟲(chóng)病中，TGF-β1分泌可以阻斷巨噬細(xì)胞活化，并削弱它們的氧化反應(yīng)[6]，人類(lèi)腹腔和腸道炎癥疾病中，TGF-β1信號(hào)減少[7]。在免疫系統(tǒng)中，成熟的TGF-β1多肽是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分化調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑，并能下調(diào)許多細(xì)胞因子的表達(dá)。例如，TGF-β1通過(guò)Smad3信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)[8]，通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β靶基因Id3抑制B細(xì)胞的增殖[9]，也可以誘導(dǎo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)，促使傷口上的成纖維細(xì)胞增殖[10]。

在魚(yú)類(lèi)研究中，TGF-β1序列已經(jīng)從虹鱒、斑馬魚(yú)、鯉魚(yú)、草魚(yú)、金魚(yú)、真鯛和海鱸中克隆得到[11-17]，其功能研究報(bào)道主要如下：哺乳類(lèi)重組TGF-β1可以抑制虹鱒巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活動(dòng)和頭腎白細(xì)胞產(chǎn)生巨噬細(xì)胞活化因子[18-19]；可以誘導(dǎo)草魚(yú)外周血液淋巴細(xì)胞的增殖，也可以阻斷由植物血凝素或者脂多糖刺激引起的草魚(yú)外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[14]；可以抑制斑馬魚(yú)卵細(xì)胞成熟，其作用的多位點(diǎn)包括LHR, 20β HSD 和mPR-β[12,20]。重組金魚(yú)TGF-β1蛋白能夠誘導(dǎo)金魚(yú)成纖維細(xì)胞(CCL71)的增殖，對(duì)TNF-α活化巨噬細(xì)胞的硝化氧化反應(yīng)有下調(diào)作用[15]。在大西洋鮭中，TGF-β1下調(diào)可導(dǎo)致上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞敏化性增強(qiáng)，不能維持正常的遠(yuǎn)端腸道黏膜的完整性[21]。

本研究通過(guò)中間片段克隆并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到了斜帶石斑魚(yú)EpinepheluscoioidesTGF-β1 cDNA全長(zhǎng)序列，并通過(guò)Realtime PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在健康斜帶石斑魚(yú)不同組織的分布情況，還檢測(cè)了用PolyI:C或ConA刺激斜帶石斑魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞不同時(shí)間后，TGF-β1基因的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚(yú)和樣品的采集

實(shí)驗(yàn)用健康斜帶石斑魚(yú)，2齡，長(zhǎng)25～30 cm，體質(zhì)量約700 g，購(gòu)自大亞灣水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)前至少暫養(yǎng)1周。取樣時(shí)先用 MS-222(Sigma，美國(guó))麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)并抽出血液，再取所需各組織樣品，用液氮速凍保存，然后放于 -80 ℃冰箱備用。

1.2 TGF-β1 cDNA的克隆和測(cè)序

用常規(guī)Trizol(Invitrogen，美國(guó))抽提法從斜帶石斑魚(yú)腎臟中提取總RNA，將總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，日本)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并以此作為模板利用簡(jiǎn)并引物(表1)擴(kuò)增TGF-β1中間片段，然后利用特異性引物(表1)結(jié)合RACE技術(shù)得到全長(zhǎng)TGF-β1 cDNA序列。PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T 載體中(TaKaRa，日本)，序列測(cè)序由華大基因公司完成。

1.3 生物信息學(xué)分析

用BLAST程序搜索基因庫(kù)分析TGF-β1分子的同源性，通過(guò)DNAtools 6.0分析開(kāi)放讀碼框和相應(yīng)的氨基酸序列。多重比對(duì)通過(guò)CLUSTAL W(www.ebi.ac.uk/clustalw)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)Mega 3.1軟件的N-J方法來(lái)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.4 Realtime PCR分析

Realtime PCR分析所用儀器為ABI的PRISM-7900。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)TGF-β1基因序列合成定量用特異性引物(表 1)，以斜帶石斑魚(yú)的β-肌動(dòng)蛋白cDNA作為內(nèi)參，分析TGF-β1 mRNA的表達(dá)譜。

1.5 細(xì)胞孵育和免疫刺激

實(shí)驗(yàn)魚(yú)先用MS-222麻醉并抽出血液，斷頭后取出頭腎，用RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))洗除表面血液，并將組織塊在冰上剪碎，研磨成單細(xì)胞，過(guò)300目篩得到單細(xì)胞懸浮液。4 ℃，2 000 r/min 離心10 min，用RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌沉淀兩次，去上清，加入4 mL組織培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心地鋪在3 mL淋巴細(xì)胞分離液(GE Healthcare，瑞士)中，19 ℃，1 500 r/min 離心50 min，收集淋巴細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，在27 ℃，φ=5% CO2的條件下培養(yǎng)5 h之后除去粘附細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞，重新培養(yǎng)在六孔板中，再向培養(yǎng)基中加入50 μg/mL的 PolyI:C(Amersham Bio-science，美國(guó))或10 μg/mL 的ConA(Sigma，美國(guó))，以沒(méi)加刺激物的細(xì)胞做陰性對(duì)照，設(shè)2、4、8、16和24 h 5個(gè)時(shí)間段，每個(gè)條件組設(shè)3個(gè)重復(fù)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol用于總RNA的提取，最后用Realtime PCR分析TGF-β1的表達(dá)情況。

表1 引物序列和用途

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)值采用算術(shù)平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示(n=3)。統(tǒng)計(jì)差異性用單因子方差分析中的LSD和Duncan’s檢測(cè)，0.05和0.01水平用來(lái)指示差異的顯著性，所有數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 16.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1 cDNA全長(zhǎng)序列

利用中間片段非特異性擴(kuò)增并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到了斜帶石斑魚(yú)TGF-β1 cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank 登錄號(hào)為GQ503351)，全長(zhǎng)為2 477 bp，5′非編碼區(qū)為47 bp，3′非編碼區(qū)為1 269 bp，開(kāi)放讀碼框(Open Reading From, ORF)為1 161 bp，編碼一種含386個(gè)氨基酸的多肽，包括含信號(hào)肽的前導(dǎo)肽和含112個(gè)氨基酸的成熟肽。在3′非編碼區(qū)polyA前共有5個(gè)在細(xì)胞因子上常見(jiàn)的mRNA不穩(wěn)定點(diǎn)(ATTTA)和一個(gè)多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)。

2.2 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取的其它物種及其基因在GenBank的氨基酸序列號(hào)列舉如下：斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides，ACV96791；海鱸Moronechrysops×Moronesaxatilis，AAD46997；真鯛Sparusaurata，AAN03842；虹鱒Oncorhynchusmykiss，CAA67685；斑馬魚(yú)Daniorerio，AAI62361；大西洋鮭Salmosalar，ACN11294；草魚(yú)Ctenopharyngodonidella，ABU84814；鯉魚(yú)Cyprinuscarpio，AAF22573；金魚(yú)Carassiusauratus，ABU55371；蠑螈Ambystomamexicanum，ABX24523；牛Bostaurus，AAA30778；馬Equuscaballus，AAD49431；豬Susscrofa，AAC83807；挪威鼠Rattusnorvegicus，AAH76380；家鼠Musmusculus，AAH13738；長(zhǎng)尾猴Chlorocebusaethiops，AAA35369；人Homosapiens，AAH01180。

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，在前導(dǎo)肽區(qū)域有整合素結(jié)合位點(diǎn)(RGD)和KEX-Furin樣蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(RKKR)；成熟肽區(qū)域有36位點(diǎn)的脯氨酸和46位點(diǎn)的甘氨酸以及由9個(gè)半胱氨酸組成的典型的“cysteine knot”結(jié)構(gòu)(圖 1)。用MEGA3.1鄰接法構(gòu)建TGF-β1家族進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，斜帶石斑魚(yú)和其他魚(yú)類(lèi)進(jìn)化樹(shù)在同一分支上，與海鱸親緣關(guān)系最近，與兩棲類(lèi)和哺乳類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)。

圖1 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1的氨基酸序列與已知的其它魚(yú)類(lèi)序列的比較

2.3 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1的組織表達(dá)分析

Realtime PCR 結(jié)果表明，斜帶石斑魚(yú)TGF-β1基因在腎臟、頭腎、脾臟、鰓、肝臟、腸道、心臟、肌肉、腦、性腺、眼各組織中均有表達(dá)，其中在腎臟中表達(dá)最高，其次是頭腎和脾臟，在肌肉和眼中表達(dá)最少(圖 3)。

圖2 斜帶石斑魚(yú)和其它動(dòng)物TGF-β1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)構(gòu)建

圖3 TGF-β1在健康斜帶石斑魚(yú)各組織中的表達(dá)分析

2.4 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1在刺激頭腎淋巴細(xì)胞中的表達(dá)分析

Realtime PCR 結(jié)果表明，用PolyI:C或ConA刺激頭腎淋巴細(xì)胞后，斜帶石斑魚(yú)TGF-β1表達(dá)量都明顯上升，刺激4 h后達(dá)到最高，其中ConA組是對(duì)照組表達(dá)量的27倍，PolyI:C組是對(duì)照組的3倍。刺激4 h后表達(dá)量均有所下降，其中用PolyI:C刺激頭腎淋巴細(xì)胞16、24 h后，TGF-β1基本無(wú)表達(dá)，而用ConA刺激實(shí)驗(yàn)組，雖然在4 h后TGF-β1表達(dá)量有所下降，但一直高于對(duì)照組(P<0.05)，特別在刺激4、8、16 h后，表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖 4)。

圖4 斜帶石斑魚(yú)TGF-β1在刺激頭腎淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

本研究克隆得到了斜帶石斑魚(yú)TGF-β1全長(zhǎng)cDNA序列，在成熟肽區(qū)域，具有和其他魚(yú)類(lèi)一樣保守的9個(gè)半胱氨酸組成的典型的“cysteine knot”結(jié)構(gòu)[12,15,17,22]，其中的8個(gè)半胱氨酸以成對(duì)的方式形成分子中心區(qū)的4對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵，結(jié)合第9個(gè)半胱氨酸形成鏈間二硫鍵一起形成TGF-β二聚體[11]。整合素結(jié)合位點(diǎn)(RGD)能夠與整合素特異結(jié)合，例如能夠與αvβ6特異結(jié)合，從而使?jié)摶钚偷腡GF-β1活化[23]，KEX-Furin樣蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)(RKKR)可以使前體蛋白轉(zhuǎn)化為成熟蛋白，另有研究顯示C型膠原蛋白酶也可通過(guò)此位點(diǎn)裂解TGF-β前期復(fù)合物[11]，以及成熟肽36位點(diǎn)的脯氨酸和46位點(diǎn)的甘氨酸，都表明斜帶石斑魚(yú)TGF-β1具有超家族特征標(biāo)志[22]，延續(xù)了TGF-β1基因在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

TGF-β1基因在所取斜帶石斑魚(yú)的各個(gè)組織中都表達(dá)，而在虹鱒和草魚(yú)中，TGF-β1基因在肝臟中檢測(cè)不到表達(dá)[11,14]，在鯉魚(yú)肌肉中檢測(cè)不到表達(dá)[13]，表明TGF-β1在魚(yú)類(lèi)各組織中的表達(dá)具有一定差異性。在硬骨魚(yú)類(lèi)，像草魚(yú)和斑馬魚(yú)，腎臟是主要的B細(xì)胞產(chǎn)生和結(jié)合位點(diǎn)[24]；虹鱒中，發(fā)育中的B細(xì)胞在頭腎中成熟，然后遷移到脾臟或者后腎的活化位點(diǎn)[25]；脾臟是免疫球蛋白M在軟骨魚(yú)類(lèi)表達(dá)的第一個(gè)站點(diǎn)[26]，斜帶石斑魚(yú)TGF-β1基因在腎臟、頭腎、脾臟中高表達(dá)，表明TGF-β1基因在斜帶石斑魚(yú)免疫系統(tǒng)中可能具有潛在功能。

用PolyI:C和ConA刺激斜帶石斑魚(yú)頭腎淋巴細(xì)胞后，TGF-β1基因表達(dá)量升高，這與在鯉魚(yú)頭腎白細(xì)胞中觀察到的結(jié)果一致[13]。另有報(bào)道表明，在金魚(yú)和虹鱒中，用LPS和rTNF-α刺激的巨噬細(xì)胞中，TGF-β1基因表達(dá)量也上升[15,27]。因此，斜帶石斑魚(yú)TGF-β1的表達(dá)量在刺激后有所上升，表明了TGF-β1對(duì)類(lèi)似有絲分裂類(lèi)因子的刺激，與其它典型的細(xì)胞因子一樣做出了積極反應(yīng)，對(duì)淋巴細(xì)胞的活化是必不可少的[28]。在刺激超過(guò)4 h后，可能是前4 h大幅增加的TGF-β1抑制了淋巴細(xì)胞的增殖，從而使TGF-β1表達(dá)量下降，有研究報(bào)告表明，LPS和ConA可誘導(dǎo)鯉魚(yú)外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[29]，而rTGF-β1可以阻斷由PHA和LPS誘導(dǎo)的草魚(yú)外周血液淋巴細(xì)胞的增殖[14]，表明TGF-β1在調(diào)控魚(yú)類(lèi)淋巴細(xì)胞的增殖方面和哺乳類(lèi)具有相似的作用，但其作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

TGF-β1作為一種多效應(yīng)的細(xì)胞免疫因子，其功能在哺乳動(dòng)物中研究較多，作用的效果取決于多項(xiàng)因素，如分泌的時(shí)間，濃度，受體的表達(dá)，細(xì)胞分化的周期等[30-32]，但是在魚(yú)類(lèi)，對(duì)TGF-β1的功能研究還比較少，有待進(jìn)一步發(fā)展和完善。

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