陳玉萍，魏東寧，肖 漓

0 引 言

MG是乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫和補(bǔ)體參與其發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞免疫紊亂是MG發(fā)病的重要原因之一。正常情況下，機(jī)體外周血中CD4+/CD8+T細(xì)胞比值相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)T細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能異常時(shí)，機(jī)體免疫功能紊亂并導(dǎo)致一系列病理變化。研究已證實(shí)MG患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群異常，表現(xiàn)為CD8+T細(xì)胞百分比下降，導(dǎo)致CD4+/CD8+比值升高［1］。胸腺切除術(shù)及激素治療 MG通過調(diào)整T淋巴細(xì)胞亞群異常，恢復(fù)正常T細(xì)胞免疫而發(fā)揮治療作用的［2］。因此 T淋巴細(xì)胞在 MG的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中起重要作用。本文研究了112例不同年齡、性別、臨床分型MG患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布特點(diǎn)，分析藥物和手術(shù)治療的MG的轉(zhuǎn)歸與T淋巴細(xì)胞亞群異常的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 112例MG患者為我院神經(jīng)內(nèi)科重癥肌無力治療中心2008年1月至2010年1月的住院患者，均根據(jù)典型病史、臨床體征、新斯的明試驗(yàn)、重復(fù)電刺激及胸部CT檢查而確診。其中男女性各56例，年齡3～77歲，平均(35.5±18.4)歲。病程0.5月～21年，其中1年以下70例，1年以上42例。按Osserman臨床分型，Ⅰ型(單純眼肌型)40 例(35.7%);Ⅱ型(全身型)69 例(61.6%)，其中ⅡA(輕度全身型)20例，ⅡB(中度全身型)49例;Ⅲ型(急性重癥型)3例(3.7%)。所有患者采血前6個(gè)月內(nèi)未使用免疫抑制劑。健康人對(duì)照組為我院體檢者，共50例，年齡5～80歲，平均(37.2±19.4)歲。年齡、性別與MG組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 治療情況 112例MG患者中單用溴吡斯的明片治療者50例，溴吡斯的明片+醋酸潑尼松片者22例，接受擴(kuò)大胸腺切除者40例。

1.3 外周血T、B淋巴細(xì)胞測(cè)定 用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)進(jìn)行外周血B淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定。所有MG患者入院第2天抽血檢測(cè)T、B淋巴細(xì)胞水平。采用Follicol法制備外周血單核細(xì)胞懸液。PBS重懸細(xì)胞后分裝，每管100μl。然后分別加入FITC-CD3、PE-CD8、Percp-CD45、APC-CD4 熒光標(biāo)記的單克隆抗體各10μl，另以未加抗體者作為陰性對(duì)照、熒光標(biāo)記的同型抗體作為同型對(duì)照。室溫避光孵育20 min，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞10 min，1500 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，2 ml PBS洗滌1次，重新懸浮細(xì)胞至200μl，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀為FACSCalibur，應(yīng)用Cell Quest軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和結(jié)果分析。

1.4 隨訪及療效評(píng)定 112例患者治療后接受門診、電話進(jìn)行療效的隨訪，觀察治療后服藥情況及癥狀的變化。隨訪時(shí)間為3～14個(gè)月，平均9個(gè)月。療效評(píng)定依照Monden標(biāo)準(zhǔn)［3］。A:癥狀緩解，不用藥物、無癥狀或遺留輕微癥狀，能勝任日常工作和生活);B:改善，降低藥物劑量或臨床癥狀減輕;C:無變化，臨床癥狀無改變;D:惡化，藥物用量增加或癥狀加重，包括死亡。A和B為治療有效預(yù)后良好，C和D為預(yù)后不良。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，定量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素多水平方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MG患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的分布特點(diǎn)

2.1.1 比較MG患者組與正常對(duì)照組外周T淋巴細(xì)胞亞群分布特點(diǎn) 與健康人對(duì)照組相比，MG患者外周血CD8+T細(xì)胞百分比明顯降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值異常升高(P ＜0.05)，而 CD4+T細(xì)胞百分比在2組間無差異，見表1。提示MG患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群分布異常。

表1 MG患者組與正常對(duì)照組外周CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 1 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients and controls(s)

表1 MG患者組與正常對(duì)照組外周CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 1 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients and controls(s)

組 別 n CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+50 39.92 ±8.07 26.01 ±5.34 1.54 ±0.52 MG 患者組 112 41.29 ±6.69 22.54 ±4.51 1.92 ±0.56 t－0.89 4.65 －3.09 P健康人對(duì)照組0.38 0.000 0.002

2.1.2 不同年齡、性別、臨床分型MG患者外周T淋巴細(xì)胞亞群分布特點(diǎn)的比較 不同性別和臨床分型MG患者外周血T細(xì)胞亞群分布無明顯差異。但隨年齡增加，MG患者體內(nèi)CD4+/CD8+比值升高，不同年齡組外周血CD4+T細(xì)胞百分比差異顯著，見表2。提示MG患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群分布異常隨年齡而逐漸明顯。

表2 不同年齡、臨床分型MG患者組外周CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 2 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients of different age and clinical stages(s)

表2 不同年齡、臨床分型MG患者組外周CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 2 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients of different age and clinical stages(s)

組 別 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+≤14 25 38.36 ±5.70 23.32 ±4.18 1.69 ±0.35年齡(歲) 15 ～49 64 42.22 ±6.27 22.94 ±4.29 1.92 ±0.52≥50 23 41.43 ±7.56 20.57 ±5.09 2.15 ±0.74 F 3.29 2.92 4.33 P 0.04 0.06 0.02臨床分型 Ⅰ 40 39.98±5.70 22.10±4.85 1.91±0.56ⅡA 20 40.00 ±6.44 21.65 ±4.42 1.96 ±0.63ⅡB 49 42.53 ±7.23 23.16 ±4.20 1.90 ±0.55Ⅲ 3 42.00 ±7.90 24.00 ±6.20 2.00 ±0.20 F 2.12 0.80 0.07 P 0.10 0.50 0.98

2.2 T淋巴細(xì)胞亞群異常與藥物和手術(shù)治療療效的關(guān)系 在除外年齡、性別、臨床分型及治療措施對(duì)預(yù)后影響的基礎(chǔ)上，分析患者治療前外周血T淋巴細(xì)胞亞群與經(jīng)膽堿酯酶抑制劑、糖皮質(zhì)激素及胸腺擴(kuò)大切除術(shù)后預(yù)后的關(guān)系。從表3可見，僅服用膽堿酯酶抑制劑患者預(yù)后與治療前外周血T細(xì)胞亞群百分比無關(guān)。而激素組和手術(shù)組預(yù)后良好者外周血CD8+T細(xì)胞百分比明顯低于預(yù)后不良者(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值明顯高于預(yù)后不良者(P＜0.05)，提示術(shù)前外周血T淋巴細(xì)胞亞群異?？赡苡绊懱瞧べ|(zhì)激素及胸腺擴(kuò)大切除術(shù)預(yù)后。

表3 用藥物或手術(shù)治療不同預(yù)后的MG患者外周T淋巴細(xì)胞亞群百分比(s)Table 3 Correlation between the distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and prognosis of MG after medication or thymectomy(s)

表3 用藥物或手術(shù)治療不同預(yù)后的MG患者外周T淋巴細(xì)胞亞群百分比(s)Table 3 Correlation between the distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and prognosis of MG after medication or thymectomy(s)

組 別 預(yù)后 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+A+B 30 38.84 ±7.25 24.35 ±6.62 1.75 ±0.70 C+D 20 40.65 ±7.84 24.85 ±6.64 1.75 ±0.57 t 0.77 0.07 0.00 P 0.39 0.79 1.00激素組 A+B 15 40.00 ±7.94 26.32 ±5.33 1.63 ±0.65 C+D 7 36.38 ±6.32 33.50 ±7.58 1.12 ±0.27 t 1.31 7.95 4.45 P 0.26 0.01 0.05手術(shù)組 A+B 30 39.40 ±7.36 26.10 ±6.66 1.60 ±0.57 C+D 10 38.04 ±8.95 30.74 ±9.02 1.32 ±0.62 t 0.60 7.70 5.50 P溴吡斯的明組0.44 0.01 0.02

3 討 論

MG是以乙酰膽堿受體抗體為主要抗體的自身免疫性疾病，雖然致病性免疫球蛋白是由B細(xì)胞分泌的，但其發(fā)病過程依賴調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子的參與。臨床針對(duì)B細(xì)胞的一系列治療策略并未取得進(jìn)展［4］。大量的研究側(cè)重于T細(xì)胞，尤其是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子［5－6］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)整MG患者細(xì)胞免疫紊亂，其臨床癥狀可得到明顯改善［7］。因此針對(duì)T細(xì)胞的免疫學(xué)研究是目前重癥肌無力研究的熱點(diǎn)［8］。

正常機(jī)體的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞可分為輔助性和抑制性亞群，其中CD8+為抑制性T細(xì)胞，CD4+為輔助性T細(xì)胞。兩者互相制約，維持機(jī)體的免疫平衡，已有報(bào)道，T淋巴細(xì)胞亞群失衡與自身免疫性的疾病(如原發(fā)性干燥綜合征)的關(guān)系［9］。本研究表明MG患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群分布異常，其異常主要為CD8+數(shù)量的減少，CD4+/CD8+比值異常升高，而CD4+百分比無明顯變化。這與李作孝等［1］報(bào)道的結(jié)果一致。雖然CD4+T細(xì)胞在MG中的作用近來也受到廣泛關(guān)注［5，10－11］，并證實(shí) MG患者胸腺中存在表達(dá)有Vβ5.1受體鏈的CD4+T細(xì)胞，能直接識(shí)別并作用于B細(xì)胞，產(chǎn)生乙酰膽堿受體抗體。但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)胸腺中表達(dá)Vβ5.1 CD4+T細(xì)胞的MG患者的外周血中Vβ5.1 CD4+T細(xì)胞數(shù)量并無增加［11］，提示 CD4+T細(xì)胞參與 MG的發(fā)生與其數(shù)量無關(guān)，主要是由于其其功能的改變。本研究也發(fā)現(xiàn)MG患者外周血CD4+T細(xì)胞百分比與健康人對(duì)照組相比無明顯差異，其功能是否有改變尚有待進(jìn)一步確定。CD8+T細(xì)胞為抑制性T細(xì)胞，其如何參與MG的發(fā)生目前尚存在爭(zhēng)議。一部分研究者認(rèn)為CD8+T細(xì)胞主要發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而在實(shí)驗(yàn)獲得性MG的研究模型上證實(shí)其也參與MG形成的病理過程［12］。本研究發(fā)現(xiàn)MG患者體內(nèi)CD8+抑制性T細(xì)胞數(shù)量的減少，使其抑制功能下降。雖然CD4+輔助性T細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，但可能CD4+T輔助細(xì)胞功能亢進(jìn)，促進(jìn)B細(xì)胞異常增殖，產(chǎn)生針對(duì)自身抗原乙酰膽堿的自身抗體，從而誘發(fā)MG的發(fā)生。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)隨MG患者年齡的增加其T淋巴細(xì)胞亞群異常逐漸明顯，而與性別、臨床分型無關(guān)。一方面隨著年齡的增加，機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降。劉學(xué)員等［13］研究發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，老年人外周血CD4+/CD8+比值升高，與本文的結(jié)果一致。另一方面MG患者胸腺瘤的發(fā)生率隨年齡的增加而增高，而胸腺瘤合并MG患者胸腺組織本身內(nèi)成熟的CD8+T細(xì)胞減少，存在T淋巴細(xì)胞亞群的異常［14］，使得外周血中細(xì)胞免疫紊亂更加明顯。以上兩方面因素導(dǎo)致老年MG患者中T淋巴細(xì)胞亞群異常更為明顯。本文結(jié)果還表明T淋巴細(xì)胞亞群異常與臨床分型無關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道不盡一致，有報(bào)道［2，6］認(rèn)為MG患者病情加重時(shí)，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+比值升高;而病情緩解時(shí)CD8+百分比升高，CD4+/CD8+比值下降。不同臨床分型的MG患者病情嚴(yán)重程度與T細(xì)胞亞群數(shù)量異常的嚴(yán)重程度并不平行，可能更決定于T細(xì)胞亞群功能異常。研究也證實(shí)眼肌型和全身型MG患者外周血CD4+T細(xì)胞對(duì)乙酰膽堿受體的反應(yīng)不同，提示不同臨床類型MG患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞功能存在差異［15］。

此外本研究結(jié)果表明治療前患者T細(xì)胞亞群紊亂明顯者，即CD8+百分比下降、CD4+/CD8+比值升高明顯者，經(jīng)糖皮質(zhì)激素及胸腺擴(kuò)大切除術(shù)療效較好。此結(jié)果間接證實(shí)糖皮質(zhì)激素及胸腺擴(kuò)大切除術(shù)通過調(diào)整細(xì)胞免疫功能紊亂而發(fā)揮治療MG作用。這與文獻(xiàn)報(bào)道激素或胸腺手術(shù)治療后MG患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值恢復(fù)正常［16］，以及胸腺切除術(shù)后甲狀腺功能紊亂得到糾正相一致［17］。另一方面，此結(jié)果也提示治療前T細(xì)胞亞群紊亂明顯的患者，其細(xì)胞免疫紊亂在MG發(fā)病中占主導(dǎo)作用，細(xì)胞免疫紊亂逐漸得到糾正后，其臨床癥狀明顯改善。因此檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分比對(duì)于指導(dǎo)臨床治療、判斷預(yù)后有重要意義。

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