楊前勇，聶 忠，宋寧燕

0 引 言

DN是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥和主要死亡原因［1－2］。近年來研究表明，NO、NOS活性的改變是導(dǎo)致DN的重要機(jī)制之一［3－4］。噻唑烷二酮類藥物(Thiazolidinediones，TZDs)是一種新型胰島素增敏劑，其對(duì)DN的保護(hù)已為一系列臨床與實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)，其確切的保護(hù)機(jī)制尚未明了［5］。本研究擬從NO、NOS的角度，探討吡格列酮對(duì)DN的防治作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(德國(guó) Boehringer-Manmheim公司)，吡格列酮原藥，考馬斯亮藍(lán)試劑、NO、NOS檢測(cè)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，其他儀器主要有金屬代謝籠、紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó) Beckman公司)、低溫離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司)、血糖儀及試紙(美國(guó) SureStep穩(wěn)步系列)。

1.2 動(dòng)物及分組 健康雄性Wistar大鼠(由第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，平均體重(235±10)g，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房，12 h明暗交替光下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK-(滬)2006-0029。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、正常對(duì)照治療組、糖尿病組，糖尿病治療組，每組10只。

1.3 糖尿病模型建立及給藥 將鏈脲佐菌素溶于pH4.5的檸檬酸緩沖液中，按55 mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射，3 d后采用血糖儀測(cè)定尾靜脈全血血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)。兩治療組以吡格列酮10 mg/(kg·d)(混懸于羧甲基纖維素鈉溶液中)灌胃，其余2組給予等劑量溶媒灌胃。

1.4 標(biāo)本收集與檢測(cè) 第10周末用代謝籠準(zhǔn)確收集24 h尿標(biāo)本，記錄尿量后取4 ml，2000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，去除沉渣并于－20℃冰箱保存待測(cè)。尿蛋白用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)。留尿后麻醉大鼠，摘眼球取血，取大鼠腎稱重，計(jì)算腎重/體重。每周用血糖儀及試紙測(cè)定空腹時(shí)尾靜脈血糖。

1.5 血清NO含量及NOS活性測(cè)定(帶分型) 大鼠麻醉后取血，按試劑盒要求分離血清，－20℃冰箱保存待測(cè)。測(cè)定NO含量，T-NOS、iNOS和cNOS活性，以上操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較若滿足正態(tài)性且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，兩兩組間比較用LSD法，方差不齊時(shí)兩兩組間比較選擇Tamhane’s T2法。P≤0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血糖、體重、腎重、腎重/體重和24 h尿蛋白定量變化比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病組血糖、腎重/體重和24 h尿蛋白定量明顯升高。與糖尿病組比較，糖尿病治療組血糖無顯著差異，但腎重/體重和24 h尿蛋白定量明顯降低。正常對(duì)照組與正常對(duì)照治療組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 各組大鼠血清 NO水平和 T-NOS、iNOS、cNOS活性變化比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病組NO水平和T-NOS、iNOS活性明顯增加。與糖尿病組比較，糖尿病治療組NO水平和T-NOS、iNOS活性明顯下降。cNOS活性各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 各組大鼠血糖、體重、腎重、腎重/體重與24 h尿蛋白定量的變化±s)Table 1 Changes in blood glucose，body weight，kidney weight，kidney weight index and 24h urinary protein content of the animals studied(±s)

表1 各組大鼠血糖、體重、腎重、腎重/體重與24 h尿蛋白定量的變化±s)Table 1 Changes in blood glucose，body weight，kidney weight，kidney weight index and 24h urinary protein content of the animals studied(±s)

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與正常對(duì)照治療組比較，△P＜0.01;與糖尿病組比較，▲P＜0.01

組 別 n 血糖(mmol/L) 體重(g) 腎重(g) 腎重/體重(‰) 24h尿蛋白(mg/d)正常對(duì)照組 10 5.07 ±0.32 363.20 ±25.22 1.08 ±0.06 2.98 ±0.13 4.56 ±0.33正常對(duì)照治療組 10 5.28 ±0.20 375.10 ±22.73 1.08 ±0.08 2.89 ±0.11 4.50 ±0.29糖尿病組 10 21.73 ±3.08＊△ 206.40±15.66＊△ 1.29±0.07＊△ 6.27 ±0.38＊△ 18.47±2.16＊△糖尿病治療組 10 20.90±1.78＊△ 220.70±18.19＊△ 1.13±0.11▲ 5.12±0.35＊△▲ 5.53±0.70▲

表2 各組大鼠血清NO水平和T-NOS、iNOS、cNOS活性變化(s)Table 2 Changes of the NO level and T-NOS，iNOS and cNOS activities in the serum of the animals studied(s)

表2 各組大鼠血清NO水平和T-NOS、iNOS、cNOS活性變化(s)Table 2 Changes of the NO level and T-NOS，iNOS and cNOS activities in the serum of the animals studied(s)

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.01;與正常對(duì)照治療組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與糖尿病組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 n NO(μmol/L) T-NOS(U/L) iNOS(U/L) cNOS(U/L)正常對(duì)照組 10 16.02 ±1.59 18.56 ±1.01 2.78 ±0.21 15.78 ±0.98正常對(duì)照治療組 10 15.56 ±1.47 18.76 ±1.65 2.86 ±0.12 15.90 ±1.67糖尿病組 10 54.25±2.97＊△△ 20.11±0.82＊△ 4.03±0.15＊△△ 16.08 ±0.78糖尿病治療組 10 43.71±3.38＊△△▲▲ 18.79±1.07▲ 3.06±0.25＊△▲▲15.73 ±1.03

3 討 論

DN早期以腎小球高濾過和高灌注、腎小球肥大、系膜區(qū)擴(kuò)張、基膜增厚，晚期腎小球毛細(xì)血管腔閉塞、硬化為特征［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，糖尿病模型組大鼠腎重/體重、24 h尿蛋白含量明顯增加，說明已出現(xiàn)了明顯的腎小球高濾過和腎肥大，DN尚處于早期。而吡格列酮治療組上述異常明顯減輕，表明吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎有保護(hù)作用，能減輕腎小球高濾過和腎肥大，降低尿蛋白，延緩DN的進(jìn)展。

N0是腎血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)的重要因子。其在DN中的作用較為復(fù)雜，一般認(rèn)為糖尿病早期NO產(chǎn)成增加，介導(dǎo)腎小球高濾過，是啟動(dòng)DN的重要因素，而在晚期，多種原因?qū)е碌腘O的減少則為加速腎小球硬化的因素［3］。出入球小動(dòng)脈對(duì)NO敏感性不同，局部產(chǎn)生的NO只控制入球小動(dòng)脈的阻力和超濾系數(shù)，而出球小動(dòng)脈對(duì)NO不甚敏感，故局部大量生成的NO強(qiáng)力舒張入球小動(dòng)脈而出球小動(dòng)脈舒張甚弱，致使腎小球內(nèi)壓升高，腎小球高濾過形成［6－7］。另外過多的NO還可增加球管反饋機(jī)制，這亦參與了腎高灌注、高濾過的形成［8］。

NO合成以左旋精氨酸(L-Arg)和O2為底物，NOS為氧化酶催化而產(chǎn)生。NOS家族有2類:cNOS和iNOS。cNOS包括神經(jīng)元型NOS(nNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)2種，均需Ca2+和鈣調(diào)素激活，iNOS的活化則不需要Ca2+和鈣調(diào)素作為協(xié)同因子。在腎eNOS主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，而nNOS主要存在于致密斑細(xì)胞［9］，兩者在正常生理?xiàng)l件下可催化少量的NO，參與腎血流量及水鹽代謝調(diào)節(jié)。而iNOS在生理?xiàng)l件下基因不表達(dá)，但在炎癥等病理?xiàng)l件下，如脂多糖、腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素-1等細(xì)胞因子和細(xì)菌產(chǎn)物可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞等iNOS高表達(dá)。陳燕銘等［10］報(bào)道糖尿病大鼠(鏈脲佐菌素50 mg/kg單次腹腔制備)12周時(shí)血清、尿液、腎組織中NO含量和腎iNOS的合成較正常組大鼠升高，并且與腎小球平均體積和基膜平均厚度呈正相關(guān)。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)與 NO的關(guān)系己引起較多關(guān)注，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為激活PPARγ后iNOS表達(dá)被抑制，NO水平降低，從而可抑制NO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，激活PPARγ可以抑制白細(xì)胞介素-1或脂多糖等誘導(dǎo)的單核-巨噬細(xì)胞［11－13］、呼吸道上皮細(xì)胞［14］、軟骨細(xì)胞［15］的 iNOS過表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，PPARγ配體抑制消化道潰瘍［16］、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［17］中 NO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)作用。另外，Reilly等［18］的研究也發(fā)現(xiàn)，PPARγ的配體能夠抑制體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞iNOS的過表達(dá)。腎小球系膜細(xì)胞有類巨噬細(xì)胞功能，通過合成NO和前列腺素等調(diào)節(jié)炎癥和免疫過程。由于DN發(fā)病過程伴隨炎癥反應(yīng)，如DN腎間質(zhì)可存在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和多形核白細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化。因此吡格列酮對(duì)DN的保護(hù)作用還可能與抑制NO介導(dǎo)的炎癥損傷有關(guān)。另外，抑制NO對(duì)于改善DN早期腎小球高濾過也有積極意義。由于NO在DN發(fā)病中的作用具有復(fù)雜的兩面性，因此對(duì)于PPARγ在DN中對(duì)NO的影響應(yīng)從不同時(shí)期分別研究，以進(jìn)一步明確兩者的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)吡格列酮治療組大鼠iNOS活性和NO含量較糖尿病組明顯降低，cNOS水平兩組間比較無顯著變化，表明吡格列酮可能是一種較為特異的iNOS抑制劑，能降低早期糖尿病大鼠血清NO水平，從而一定程度上減輕糖尿病大鼠腎高濾過和腎肥大，改善腎結(jié)構(gòu)和功能。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮治療組與糖尿病組大鼠間血糖無明顯差異，這表明吡格列酮不能糾正胰島素缺乏大鼠的糖代謝紊亂，它對(duì)糖尿病大鼠的腎保護(hù)作用與血糖水平無關(guān)。

吡格列酮治療能使早期糖尿病大鼠血清iNOS活性和NO水平降低，這可能是其糾正糖尿病早期腎血流動(dòng)力學(xué)紊亂、減輕腎肥大、降低蛋白尿、改善腎功能的作用機(jī)制之一。

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