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        創(chuàng)造酶切位點(diǎn)與PCR-RFLP原理在基因多態(tài)檢測(cè)中的應(yīng)用探討

        2011-07-20 10:17:50孫東杰岳馨培孫成林
        河南醫(yī)學(xué)研究 2011年3期
        關(guān)鍵詞:酶切位點(diǎn)多態(tài)堿基

        孫東杰,岳馨培,師 樂(lè),孫成林,王 威

        (鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 河南鄭州 450001)

        單核苷酸多態(tài)性(SNP)指染色體基因組水平上單個(gè)核苷酸變異。SNP檢測(cè)中,聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),特別適用于已知突變位點(diǎn)檢測(cè)[1]。對(duì)無(wú)合適內(nèi)切酶或內(nèi)切酶價(jià)格昂貴時(shí),可引入錯(cuò)配堿基創(chuàng)造酶切位點(diǎn)(Create restriction site,CRS)方法設(shè)計(jì)引物,然后進(jìn)行PCR-RFLP檢測(cè)[2]。

        該文總結(jié)了應(yīng)用CRS方法結(jié)合PCR-RFLP原理對(duì)多個(gè)SNP檢測(cè)方法的研究結(jié)果[3-6],探討了該方法在基因多態(tài)檢測(cè)中的注意事項(xiàng),為相關(guān)研究提供借鑒。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑及儀器 試劑:2×PCR mix(MBI公司),限制性內(nèi)切酶MSPI(MBI公司),瓊脂糖(BBI公司),引物由上海 Sangon公司合成。儀器:9600型PCR儀(PE公司),微型電泳槽(Pharmacia Biotech,EPS1000),Gel Doc 2000凝膠成像儀(Bio-RAD公司)。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

        1.2 方法 CRS-PCR-RFLP是根據(jù)引物堿基錯(cuò)配技術(shù)設(shè)計(jì)的檢測(cè)單堿基突變的方法。其原理是根據(jù)單堿基突變位點(diǎn)的堿基替代情況設(shè)計(jì)引物,其中一條引物根據(jù)突變位點(diǎn)鄰近序列設(shè)計(jì),引入錯(cuò)配堿基,使得引物3’端和單堿基突變的一種突變型在PCR擴(kuò)增后形成一個(gè)酶切位點(diǎn),然后應(yīng)用相應(yīng)內(nèi)切酶酶切鑒定。

        1.3 序列查找及引物設(shè)計(jì) 在NCBI網(wǎng)站查找基因序列和SNP信息,結(jié)合文獻(xiàn)確定多態(tài)堿基信息,利用Primer Premier5.0軟件分析內(nèi)切酶識(shí)別情況,設(shè)計(jì)引入錯(cuò)配堿基的引物并確定創(chuàng)造的酶切位點(diǎn)。

        1.4 PCR擴(kuò)增及酶切鑒定 取50 ng的基因組DNA、每個(gè)引物 0.2 μmol/L、1 × PCRmix、ddH2O 組成25 μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為首先94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性30 s,根據(jù)引物Tm值取(55~60)℃退火20 s,72℃延伸20 s,共30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。PCR后,取PCR產(chǎn)物10 μl,加入5 u內(nèi)切酶和2 μl 10×酶切緩沖液和ddH2O組成20 μl反應(yīng)體系,37℃水浴2~16 h后,電泳后凝膠成像觀察。

        2 結(jié)果

        2.1 序列搜索與多態(tài)位點(diǎn)確定 查找NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù),收集 MGMT、ADH2、MTHFR和 PON2基因全序列及相關(guān)多態(tài)位點(diǎn)。各基因多態(tài)位點(diǎn)情況見(jiàn)表1。

        2.2 序列分析與引物設(shè)計(jì) 經(jīng)序列分析可知可識(shí)別原多態(tài)序列的內(nèi)切酶及其價(jià)格情況,對(duì)價(jià)格較貴者進(jìn)行錯(cuò)配分析。通過(guò)堿基錯(cuò)配將多態(tài)位點(diǎn)附近堿基進(jìn)行替換,直至形成可被較廉價(jià)內(nèi)切酶識(shí)別的序列。然后根據(jù)錯(cuò)配位點(diǎn)情況確定上下游引物的位置與長(zhǎng)度(設(shè)計(jì)引物、選擇的內(nèi)切酶及其識(shí)別堿基情況見(jiàn)表1)。其中MGMT基因多態(tài)rs2308321和rs2308327因位點(diǎn)接近而設(shè)計(jì)一對(duì)特殊引物,兩引物分別進(jìn)行堿基錯(cuò)配,PCR后分別采用不同內(nèi)切酶進(jìn)行多態(tài)鑒定。

        2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 通過(guò)PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果與預(yù)期一致。不同基因型PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果亦符合預(yù)期。

        表1 基因多態(tài)位點(diǎn)信息與引物設(shè)計(jì)情況

        3 討論

        應(yīng)用CRS-PCR-RFLP進(jìn)行SNP檢測(cè),拓寬了PCRRFLP的適用范圍,在實(shí)際應(yīng)用中具有很大的靈活性,具有較好的應(yīng)用前景,特別適合于基層單位開(kāi)展已知位點(diǎn)SNP的檢測(cè)。綜合考慮有關(guān)檢測(cè)中出現(xiàn)的一些問(wèn)題,CRS-PCR-RFLP技術(shù)的應(yīng)用需要考慮以下問(wèn)題。

        3.1 SNP情況 SNP一般情況需全面掌握,主要包括基因名稱、染色體位置、rs號(hào)、堿基序列及多態(tài)堿基替代(氨基酸替代)等。

        3.2 內(nèi)切酶情況 內(nèi)切酶識(shí)別序列和價(jià)格因素要考慮,部分識(shí)別非回文序列的內(nèi)切酶識(shí)別序列可能在2種以上,盡量篩選價(jià)格便宜者以利于推廣。

        3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物情況 擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在其他SNP位點(diǎn)、酶切位點(diǎn)個(gè)數(shù)及其切開(kāi)后片段長(zhǎng)度需考慮。切開(kāi)后各個(gè)條帶之間需具備可分辨性,一般兩片段差異需超過(guò)長(zhǎng)片段的10%,通常擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100~200 bp。考慮用瓊脂糖凝膠電泳分辨,價(jià)格便宜,易于操作。必要時(shí)可考慮聚丙烯酰胺凝膠電泳。

        3.4 引物設(shè)計(jì)的原理和技巧 創(chuàng)造酶切位點(diǎn)方法可用于內(nèi)切酶價(jià)格昂貴或者無(wú)內(nèi)切酶識(shí)別的情況,另外可通過(guò)錯(cuò)配堿基消除酶切位點(diǎn)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體,或者與序列中其他位點(diǎn)的無(wú)關(guān)錯(cuò)配情況。

        [1]王威,夏昭林.人類基因組單核苷酸多態(tài)性研究與疾病三級(jí)預(yù)防體系[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè),2006,33(6):321-325.

        [2]張忠彬,朱人,夏昭林.應(yīng)用CRS-RFLP技術(shù)檢測(cè)hOGG1c.326位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性[J].中國(guó)工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2004,17(5):293-295.

        [3]王威,繆文彬,仇玉蘭,等.雙創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測(cè)MGMT基因多態(tài)性的應(yīng)用[J].衛(wèi)生研究,2008,37(1):5-8.

        [4]焦?jié)崳跬?,劉靜,等.應(yīng)用創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測(cè)乙醇脫氫酶2基因多態(tài)性[J].衛(wèi)生研究,2009,38(1):4-6.

        [5]王威,楊永利,周舫,等.創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR-RFLP檢測(cè)MTHFR(rs2274976)基因多態(tài)性[J].衛(wèi)生研究,2011,40(2):162-163.

        [6]王威,姚武,周舫,等.創(chuàng)造酶切位點(diǎn) PCR-RFLP檢測(cè) PON2(rs12026)基因多態(tài)性[J].河南醫(yī)學(xué)研究,2010,19(1):5-8.

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